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《單鏈抗體a 7基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、單鏈抗體A7基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建【摘要】［目的］構(gòu)建抗乙酰膽堿受體主要免疫原區(qū)單鏈抗體A7基因的真核表達(dá)載體，為單鏈抗體A7基因的真核表達(dá)及基因治療重癥肌無(wú)力奠定基礎(chǔ).［方法］應(yīng)用PCR技術(shù)，從已構(gòu)建的含有抗乙酰膽堿受體主要免疫原區(qū)單鏈抗體A7基因的重組原核表達(dá)載體pHEN2單鏈抗體A7上擴(kuò)增單鏈抗體A7基因并純化，將純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和AvrⅡ雙酶切后，用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收并純化，再與經(jīng)同樣酶切并純化的真核表達(dá)載體pPIC9K連接，將其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后擴(kuò)增，再用
2、AvrⅡ和EcoRⅠ酶切和測(cè)定序列檢查ScFvA7基因插入的準(zhǔn)確性.［結(jié)果］構(gòu)建pPIC9K-ScFvA7重組載體，經(jīng)序列測(cè)定檢查核苷酸序列正確，且ScFvA7基因準(zhǔn)確地克隆至載體開放讀碼框架內(nèi).［結(jié)論］成功地構(gòu)建了抗乙酰膽堿受體主要免疫原區(qū)單鏈抗體A7基因的真核表達(dá)載體.【關(guān)鍵詞】重癥肌無(wú)力；抗體；真核表達(dá)載體ABSTRACT:OBJECTIVEToconstructarecombinanteukaryoicexpressionvectorofthesinglechainvariablefra
3、gment(ScFv)A7ofantibodyagainstthemainimmunogenicregion(MIR)ofacetylcholinereceptor(AChR)forthefurthereukaryoicexpressionandthegenetherapyinmyastheniagravis(MG).11METHODSTheScFvA7genewasamplifiedbyPCRfromtherecombinantprokaryoticexpressionvectorpHEN2-
4、ScFvA7,thenpurifiedanddigestedwithEcoRⅠandAvrⅡ.ThedigestedproductswereruninlowmeltingpointagarosegeleletrophoresisandpurifiedbyWizardPCRPrepsDNAPurificationSystem,thenligatedintoeukaryoticexpressionvectorpPIC9Kdigestedandpurifiedbythesamemethod.There
5、combinantvectorpPIC9K-ScFvA7wastransformedintoE.coliDH5αforamplificationandisolatedanddigestedwithAvrⅡandEcoRⅠagain.ThepPIC9K-ScFvA7genewasanalysedforaninsertoftherightsizebydigestionwithAvrⅡandEcoRⅠ.RESULTSThesequencingshowedthatthenucleotidesequenc
6、eofconstructedScFvA7wascorrectandclonedintotheopenreadingframe(ORF)inpPIC9K.CONCLUSIONTherecombinanteukaryoicexpressionvectorpPIC9K-ScFvA7hasbeensuccessfullyconstructed.Keywords:myastheniagravis;antibodies;eukaryoticexpressionvector重癥肌無(wú)力是抗乙酰膽堿受體（acet
7、ylcholinereceptor,AchR）抗體介導(dǎo)的器官特異性自身免疫病,AchR是由α2βγδ11等5個(gè)同源亞單位組成的跨膜糖蛋白［1］.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),重癥肌無(wú)力患者血清中2/3的抗AchR抗體針對(duì)的是α亞單位的主要免疫原區(qū)的第67～76位氨基酸表位［2］.當(dāng)致病性抗體與神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上相鄰2個(gè)AchRα亞單位上的主要免疫原區(qū)結(jié)合后，通過(guò)抗原調(diào)變或激活補(bǔ)體作用使突觸后膜損傷［3］，AchR數(shù)量減少，結(jié)果出現(xiàn)受累肌肉收縮無(wú)力及麻痹癥狀［4］.由抗AchR抗體制備的單鏈抗體（singlec
8、hainvariablefragment，ScFv）作為單價(jià)片段，只能與1個(gè)α亞單位上的主要免疫原區(qū)結(jié)合，不引起抗原調(diào)變作用，且單鏈抗體無(wú)可結(jié)晶片段（Fc），不能激活補(bǔ)體導(dǎo)致AchR損傷.但單鏈抗體與主要免疫原區(qū)結(jié)合后，可特異性地封閉抗AchR抗體的結(jié)合位點(diǎn)，從而對(duì)AchR起到保護(hù)作用.本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建在原核表達(dá)載體pHEN2上的抗AchR主要免疫原區(qū)單鏈抗體A7（ScFvA7）基因克隆至真核表達(dá)載體pPIC9K上，構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體.1材料與方法1.1菌種與載體腸桿菌DH5α由荷蘭馬斯特里赫特
