抗乙酰膽堿受體單鏈抗體與人血清白蛋白融合基因真核表達載體的構(gòu)建

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1、抗乙酰膽堿受體單鏈抗體與人血清白蛋白融合基因真核表達載體的構(gòu)建作者：魏晶，李強，范華英，李芳芳，李紅花，李英信，孟繁平【摘要】目的］構(gòu)建真核表達體系，提高抗人乙酰膽堿受體單鏈抗體（ScFv637）與人血清白蛋白（HSA）融合基因（ScFv637HSA）的蛋白表達質(zhì)量.［方法］擴增ScFv637HSA融合基因，經(jīng)酶切處理后，克隆至真核載體pPIC9K，線性化處理后，電穿孔入畢赤酵母GS115.［結(jié)果］經(jīng)電泳觀察可見相對分子質(zhì)量為2.6kbp的融合蛋白ScFv637HSA基因和真核表達載體pPIC9K基因片段.［結(jié)論］ScFv637HSA基因已準(zhǔn)確地整合到畢

2、赤酵母染色體基因組中.【關(guān)鍵詞】重癥肌無力；抗體；融合基因；真核表達ConstructionofeukaryoticexpressionvectorofafusiongeneofsinglechainvariablefragmentdirectedagainstacetylcholinereceptoranserumalbuminABSTRACT:OBJECTIVEToincreasetheprotEinexpressionleveloffusiongeneofsinglechainvariablefragment(ScFv637)andhumanserumal

3、bumin(HSA)byusingeukaryoticexpressionsystem.METHODSThefusiongene(ScFv637HSA)plifiedandclonedintopPIC9KtoconstructrebinantvectorpPIC9KScFv637HSA.TherebinantvectoredintoPichiaPastorisGS115byelectroporation.RESULTSThesizesofthefusiongeneandthepPIC9Kately2.6kbpandrespectively.CONCLUSI

4、ONTheeukaryoticexpressionvector,yastheniagravis;singlechainvariablefragment;fusiongene;eukaryoticexpression重癥肌無力是抗乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)的依賴細(xì)胞免疫及補體參與的器官特異性自身免疫病,抗乙酰膽堿受體抗體的抗原結(jié)合片段（fragmentofantigenbinding，F(xiàn)ab）分別與神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜乙酰膽堿受體上2個相鄰的α亞單位結(jié)合后，通過加速乙酰膽堿受體發(fā)生抗原調(diào)變及激活補體，使乙酰膽堿受體數(shù)量減少，出現(xiàn)肌無力和麻痹癥狀［1］.由抗乙酰膽堿受體

5、α亞單位主要免疫原區(qū)抗體制備的抗原結(jié)合片段或單鏈抗體（singlechainvariablefragment,ScFv）與乙酰膽堿受體的主要免疫原區(qū)結(jié)合后，可特異性地封閉致病性抗體與乙酰膽堿受體的結(jié)合位點，從而對乙酰膽堿受體起到保護作用[2].本實驗室曾制備了人源性抗乙酰膽堿受體主要免疫原區(qū)的單鏈抗體ScFv637[3]，為了克服ScFv637半衰期短的缺點，又將其與人血清白蛋白（humanserumalbumin,HSA）相連，構(gòu)建了ScFv637HSA融合基因[4].為提高融合蛋白的表達質(zhì)量，選擇了真核表達系統(tǒng).1材料與方法1.1材料1.1.1菌種與質(zhì)粒大

6、腸桿菌DH5α由荷蘭馬斯特里赫特大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)系神經(jīng)免疫學(xué)實驗室提供，質(zhì)粒pPIC9K及畢赤酵母菌GS115由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所章金剛教授惠贈.1.1.2試劑限制性核酸內(nèi)切酶SnaBⅠ，EcoRⅠ和T4DNA連接酶為美國NEB公司產(chǎn)品；SalⅠ為大連TAKARA公司產(chǎn)品；HighFidelityPCRSystem5Kb，氨芐青霉素及其他化學(xué)試劑均為華美生物工程公司產(chǎn)品；inipreps/MidiprepsDNAPurificationSystem為美國Promega公司產(chǎn)品；TAKARADNAATailingKit，TAKARADNALigationK

7、it和pMD18TSimpleVector均為大連TAKARA公司產(chǎn)品.1.1.3引物合成根據(jù)原核表達載體pHEN2ScFv637HSA[4]中ScFv637前10位氨基酸序列設(shè)計5′引物，再根據(jù)cmyc后10位氨基酸互補核苷酸序列設(shè)計3′引物，VH5′引物為GACTTACGTAGAGGTGCAGCTGCTGGAG，cmyc3′引物為CGGAATTCATTCAGATCCTCTTCTGAGATG，其中畫線部分分別引入了SnaBⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點，引物由大連TAKARA公司合成.1.2方法1.2.1PCR擴增ScFv637HSA基因在50μL反

8、應(yīng)體系中依次加入無菌去離