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《重組cd13單鏈抗體-蝎毒素agap原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、重組CD13單鏈抗體/蝎毒素AGAP原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建論文駱超，倪吳花，胡永仙，譚映霞，沈志堅(jiān)，江松福，俞康【摘要】目的：構(gòu)建pRSETA/AGAP/CD13scFv重組表達(dá)質(zhì)粒，為重組CD13單鏈抗體/蝎毒素AGAP融合蛋白的表達(dá)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:利用RT-PCR法從東亞鉗蝎尾腺中獲得AGAP目的基因.freelidpRSETA/AGAP/CD13scFvthatcontributestotheexpressionoffusionproteinAGAP/CD13scFv.Methods:TheAGA
2、PgeneButhusmartensiiKarschusingRT-PCR，thenitidPCR-TOPOandtransferredtoDH5α.TheobjectivegeneAGAPtherebinantcloningplasmid，andconnectedtotheexpressionplasmidpRSETAthateenzymes.Subsequently，CD13scFvplifiedfromplasmidpSecTag2HygroCidedigestionanalysisandsequ
3、encing.Results:TherebinantexpressionplasmidpRSETA/AGAP/CD13scFvButhusmartensiiKarschusingRT-PCR.CD13scFvcanbeamplifiedfromplasmidpSecTag2HygroCidpRSETA/AGAP/CD13scFvaresuccessfullyconstructed.TheconstructionofpRSETA/AGAP/CD13scFvhasagreatconstributionnot
4、onlytotheexpressionoffusionprotein，butalsotothetherapyofCD13positivetumors.CD13抗原在正常的髓細(xì)胞中有表達(dá)，但在急、慢性髓細(xì)胞白血病、骨髓增生異常綜合征和部分淋巴瘤中均高度表達(dá)，因此可以作為腫瘤靶向治療較為理想的靶點(diǎn)1。蝎毒素抗瘤止痛肽（AGAP）經(jīng)證實(shí)在小鼠體內(nèi)具有抗腫瘤和止痛活性2-3，為此，我們利用CD13單鏈抗體（CD13scFv）、AGAP構(gòu)建pRSETA/AGAP/CD13scFv原核表達(dá)載體，為該重組質(zhì)粒體外融合
5、蛋白的表達(dá)及今后研究CD13scFv和蝎毒素AGAP協(xié)同性殺傷CD13陽性腫瘤細(xì)胞提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料東亞鉗蝎（購自中華蝎子養(yǎng)殖有限公司），含CD13scFv的pSecTag2HygroC質(zhì)粒（由德國Erlangen-Nuremberg大學(xué)生物遺傳學(xué)研究所主席KarinBarbin教授惠贈(zèng)），pRSETA表達(dá)質(zhì)粒（由北京大學(xué)麻洪博士惠贈(zèng)），Trizol試劑、TOPO載體（購自美國Invitrogen公司），F(xiàn)ermentasFirstStrandcDNASynthesi
6、sKit、PCRmix(均購自MBI公司)，HindIII內(nèi)切酶、XhoI內(nèi)切酶、EcoRI內(nèi)切酶、T4DNALigase（均購自美國Biolabs公司），X-Gal、IPTG（均購自BBI公司），膠回收試劑盒、質(zhì)粒小抽試劑盒（購自德國Qiagen公司），DH5α菌、JM109菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2方法1.2.1以RT-PCR法從東亞鉗蝎中獲得AGAP目的基因：電刺激東亞鉗蝎尾部，剪取其尾腺，在液氮下研磨，以Trizol一步法從中提取總RNA，F(xiàn)ermentas逆轉(zhuǎn)錄初始鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為
7、cDNA，并以cDNA為模板，用PCRmix進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因。PCR引物根據(jù)Genbank中AGAP序列(No.AF464898)設(shè)計(jì)，引物為上游：5’CGGAATTCGAGtacgcgatggttatattgccgac3’，下游：5’CCCAAGCTTGCaccgccattgcattttcctggtact3’，劃線處分別為EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)，前后各有2～3個(gè)保護(hù)性堿基。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min，再以94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，共24
8、個(gè)循環(huán)。最后以72℃延伸10min。1.2.2PCR法從pSecTag2HygroC質(zhì)粒中獲得CD13scFv目的基因：用PCRmix進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因，據(jù)德國GeorgH.Fey教授惠贈(zèng)的CD13scFv序列設(shè)計(jì)其引物，上游：5’CCGCTCGAGatggcggactacaaagacgttgtga3’，下游：5’GGAATTCCggcggccgcactgccGccaccacca3’，劃線處分別為XhoI、EcoRI酶切位點(diǎn)，前后各
