大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與蛋白表達(dá)純化

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1、8.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與蛋白表達(dá)純化大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚，目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)等特點(diǎn),是分子生物學(xué)研究和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)程中的重要工具。因此熟練掌握并運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基本原理和常規(guī)操作是對(duì)每一個(gè)研究生來說是非常必要的。本章節(jié)介紹了實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成特點(diǎn)，歸納了利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)純化重組蛋白的基本流程和詳細(xì)操作步驟，并且結(jié)合筆者的操作經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了初學(xué)者在操作過程中可能遇到的問題和解決策略。8.1大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇與構(gòu)建8.1.1表達(dá)載體的選擇根據(jù)啟動(dòng)子的不同這些載體大致可以分為熱誘導(dǎo)

2、啟動(dòng)子，如λPL，cspA等和另外一類就是廣泛使用的IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如lac，trc，tac，T5/lacoperator，T5/lacoperator等。根據(jù)表達(dá)蛋白質(zhì)的類型可分為單純表達(dá)載體和融合表達(dá)載體。融合表達(dá)是在目標(biāo)蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促進(jìn)蛋白的正確折疊，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的快速親和純化，或者實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)定位。常用的用于親和純化融合標(biāo)簽包括Poly-Arg，Poly-His,Strep-TagⅡ，S-tag，MBP等。其中His-Tag和GST-Tag是目前使用最多的。HisTag大多數(shù)是連續(xù)的

3、六個(gè)His融合于目標(biāo)蛋白的N端或C端，通過His與金屬離子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+的螯合作用而實(shí)現(xiàn)親和純化，其中Ni2+是目前使用最廣泛的。His標(biāo)簽具有較小的分子量，融合于目標(biāo)蛋白的N端和C端不影響目標(biāo)蛋白的活性，因此純化過程中大多不需要去除。目前常使用的表達(dá)載體主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。除了His標(biāo)簽外，還原性谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是另一種實(shí)驗(yàn)室常用的融合標(biāo)簽。它可以通過還原性谷胱甘肽瓊脂糖親和層析而快速純化。此外，與His相比，GST很多時(shí)候能夠促進(jìn)目標(biāo)蛋白的正確折疊，提高目標(biāo)

4、蛋白表達(dá)的可溶性，因此，對(duì)于那些用his標(biāo)簽表達(dá)易形成包涵體的蛋白，可以嘗試用GST融合表達(dá)來改進(jìn)。當(dāng)然，GST具有較大的分子量（26kDa），可能對(duì)目的蛋白的活性有影響，因此很多時(shí)候切除GST是必須的。目前，GST融合表達(dá)系統(tǒng)主要是由GEHealthcare（原Amersham）提供。8.1.2宿主菌的選擇重組質(zhì)粒的構(gòu)建一般選擇遺傳穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率高，質(zhì)粒產(chǎn)量高的菌株作為受體菌，常用的有E.coliDH5α，E.coliJM109，E.coliDH10B，E.coliNovaBlμe等recA–和endA–型細(xì)胞。作為表達(dá)宿主菌必須具備幾個(gè)基

5、本特點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定，生長(zhǎng)速度快，表達(dá)蛋白穩(wěn)定。具體操作過程中，根據(jù)所使用的表達(dá)載體的特點(diǎn)，目的基因密碼子的組成等選擇特定的表達(dá)宿主菌。以下是實(shí)驗(yàn)室常用的幾種表達(dá)宿主：BL2：lon和ompT蛋白酶缺陷型，避免了宿主對(duì)外源蛋白的降解。是經(jīng)典的使用最廣泛的表達(dá)受體。適用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作為啟動(dòng)子的載體。BL21（DE3）：DE3噬菌體溶源于BL21形成的帶有染色體T7RNA聚合酶基因大腸桿菌。IPTG誘導(dǎo)的lacΜV5啟動(dòng)子控制T7RNA聚合酶基因表達(dá)T7RNA聚合酶，進(jìn)而控制T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白。BL21（DE3）

6、衍生系列：在經(jīng)典的T7表達(dá)系統(tǒng)BL21（DE3）的基礎(chǔ)上，Novagen公司開發(fā)了一些特殊的表達(dá)宿主細(xì)胞。比如：Origami（DE3），OrigamiB（DE3）和Rosetta-gami（DE3）菌株帶有trxB和gor雙突變。擁有trxB和gor突變的菌株比單具，trxB突變的菌株更有可能促進(jìn)二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。Rosetta?系列：是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。經(jīng)提高稀有tRNA水平，可以提高一些真核基因表達(dá)效率（更多信息可參考相應(yīng)公司的資料）。BL21-CodonPlus系列：包

7、括BL21-CodonPlus?（DE3）-RIPL，BL21-CodonPlμs?-RIL，BL21-CodonPlμs?（DE3）-RIL,BL21-CodonPlμs?-RP，BL21-CodonPlus?（DE3）-RP等。這些受體菌添加了大腸桿菌中編碼精氨酸（R），亮氨酸（L），異亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密碼子的tRNA基因，更多用于表達(dá)一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息參考Stratagene公司資料）。M15/SG13009：自身表達(dá)T5RNApolyme

8、rase，主要用于pQE系列載體的表達(dá)。另一個(gè)需要考慮的是大腸桿菌的密碼子及其偏愛性。表1大腸桿菌密碼子使用頻率統(tǒng)計(jì)　TAAFRQCAAFRQAAAFRQGAAFR