資源描述：
《兩種大腸桿菌表達(dá)融合蛋白的純化》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、兩種大腸桿菌表達(dá)融合蛋白的純化作者：王飆落 陳南春 陳蘇民【關(guān)鍵詞】融合蛋白 關(guān)鍵詞:融合蛋白;純化 0引言 利用原核生物來表達(dá)外源蛋白是一種簡便高效的獲取重組產(chǎn)物的方法.但是，重組蛋白在大腸桿菌中往往形成不溶解的無活性的包涵體，僅有少量產(chǎn)物以溶解狀態(tài)存在.我們通過兩種不同的純化方式，對如何獲得有活性的蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步的探討. 1材料和方法 1.1材料融合表達(dá)質(zhì)粒pJLcIIras和pGEX-4T-mcp分別由陳蘇民教授和王字玲博士惠贈.大腸桿菌菌株TAP106和JM109及GST親和層析柱，Sepharose4B層析柱和其他生化制劑均由本校生
2、化教研室提供. 1.2方法將質(zhì)粒pJLcIIras，pGEX-4T-mcp分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)TAP106，JM109，接種擴(kuò)增后提取質(zhì)粒行酶切鑒定.鑒定后菌種擴(kuò)增至對數(shù)期，分別行37℃4水浴和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，集菌并裂菌后120g・L-1SDS-PAGE分別鑒定菌體、裂菌后上清及沉淀中融合蛋白p21ras和GST-MCP-1表達(dá)情況［1］.誘導(dǎo)擴(kuò)增后的菌液離心收集菌體，裂菌，TritonX100等去垢劑反復(fù)洗滌，最終離心后沉淀用8mol・L-1尿素溶液溶解.其中p21ras溶液分別針對4，2，1，0.5，0.25，0.1，Sepha
3、rose4B凝膠柱平衡液進(jìn)行緩慢梯度透析，終溶液經(jīng)Sephrose4B柱層析后測定產(chǎn)物的GTP結(jié)合活性.GST-MCP-1則針對GST親和層析柱平衡液透析，離心后行GST親和柱層析，產(chǎn)物經(jīng)48孔微型趨化裝置測定其趨化活性［2］. 2結(jié)果 兩種質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定符合構(gòu)建條件.轉(zhuǎn)化后的TAP106菌擴(kuò)增及37℃誘導(dǎo)后，120g・L-1SDS-PAGE檢測可見在約23ku處出現(xiàn)一條新生條帶（圖1）.紫外掃描測定約占菌體蛋白的15.6%.轉(zhuǎn)化后的JM109菌IPTG誘導(dǎo)后可見于30ku處出現(xiàn)一新生條帶（圖2）.紫外掃描測定約占菌體總蛋白的31.6%.兩
4、新生條帶分別符合融合蛋白p21cIIras和GST-MCP-1的分子大小.裂菌后的沉淀經(jīng)TritonX100等溶液反復(fù)洗滌后，雜蛋白條帶明顯減少.產(chǎn)物p21cIIras經(jīng)梯度透析后過柱純化，具備明確的GTP結(jié)合活性.而GST-MCP-1溶液經(jīng)平衡透析后則直接行親和層析，終產(chǎn)物有明確的單核細(xì)胞趨化活性. 圖1略 圖2略4 3討論 在原核生物尤其是大腸桿菌中表達(dá)外源基因產(chǎn)物時，所表達(dá)的真核生物蛋白的活性常難以保持.因原核生物的蛋白合成缺乏真核生物所具有的如糖基化等修飾過程，并且缺乏一些在肽鏈形成過程中必要的誘導(dǎo)分子，所以常常在胞質(zhì)中形成難以溶解的無活性的
5、包涵體［3，4］. 我們實(shí)驗中所見兩種融合蛋白均主要以包涵體形式存在，雖然為初步的純化提供了有利條件，但卻無法得到充足的具有生物活性的重組蛋白產(chǎn)物.考慮到包涵體的形成主要與肽鏈合成速率過快，沒有足夠的時間和空間進(jìn)行折疊和盤曲等空間構(gòu)象的形成［5］，本實(shí)驗采取了先用變性劑溶解包涵體，再通過緩慢的梯度透析逐漸除去變性劑，在這一過程中相當(dāng)一部分肽鏈得以恢復(fù)其天然構(gòu)象，成為可溶狀態(tài)，經(jīng)柱層析純化后證實(shí)產(chǎn)物具有生物活性.本實(shí)驗結(jié)果還表明，融合蛋白的表達(dá)方式不會對其生物學(xué)活性產(chǎn)生嚴(yán)重影響.設(shè)計合理的融合表達(dá)產(chǎn)物不但可使純化過程簡化，而且產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中酶切位點(diǎn)的存在也為進(jìn)一
6、步獲取更高純度和活性的重組蛋白創(chuàng)造了條件［6］. 參考文獻(xiàn): ?。?］薩姆布魯克，弗里奇，曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗指南［M］.北京:科學(xué)出版社，1992:20-35.4［2］陳蘇民.大腸桿菌中高表達(dá)era重組蛋白的純化及生化特性［J］.生物化學(xué)雜志，1992;1:33-41.［3］KungHF.SolubilityofrecombinantproteinsexpressedinE.coli［J］.CurrResProtChem，1990;3:467-476. ［4］GribskowM.Overexpressionandpurificationofthes
7、igmasub-unitofE.coliRNApolymerase［J］.Gene，1993;26:109-118. ［5］陳蘇民.era基因的高表達(dá)［J］.生物工程學(xué)報，1991;3:201-206.［6］SmithDB，JohnsonKS.Single-stepputificationofpolypeptidesexpressedinE.coliasfusionswithglutathioneS-transferase［J］.Gene，1988;67:31-34.4
