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1、優(yōu)秀畢業(yè)論文南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文BDNF-TAT融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化及體外活性測(cè)定姓名：羅道飛申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：藥劑學(xué)指導(dǎo)教師：季愛(ài)民20110527精品參考文獻(xiàn)資料優(yōu)秀畢業(yè)論文碩士學(xué)位論文BDNF．TAT融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化及體外活性測(cè)定碩士研究生：羅道飛指導(dǎo)教師：季愛(ài)民教授摘要神經(jīng)退行性疾病，如老年性癡呆(Alzheimer'sdiseaseAD)、帕金森氏癥(Parkinson’sdiseasePD)、萎縮性側(cè)索硬化(Amyotrophiclateralsclerosis，A
2、LS)、和亨廷頓氏病(Huntington’sdiseaseHD)等，臨床表現(xiàn)為肢體運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶等功能障礙，主要原因是神經(jīng)元功能的缺失或死亡。目前沒(méi)有理想的治療手段，在我國(guó)AD和PD這兩種疾病已經(jīng)累及大約1000萬(wàn)人給個(gè)人家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)【l】。研究表明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員(neurotrophicfactors，NTFs)等，顯示了很好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病的治療前景【2l。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員包括之一，與其特異性受體酪氨酸激酶家族成員trkB結(jié)合，激活下游的信
3、號(hào)傳導(dǎo)途徑，而發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生物活性p】。然而，血腦屏障(BBB)阻礙了大分子藥物從JllL液中進(jìn)入大腦發(fā)揮生理作用，人大腦血腦屏障(BBB)由血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接組成，BBB腔內(nèi)面為血液，腔外面多為外膜細(xì)胞，星行細(xì)胞及少量的神經(jīng)元。天然BDNF不能透過(guò)BBB進(jìn)入大腦發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性f51。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(proteintransductiondomain。PTD)，如來(lái)源于人類(lèi)I型免疫缺陷病毒的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Tram．a(chǎn)ctivatortranscription，TAT)的PTI)，是一類(lèi)富含正電荷能夠?qū)⑴c其
4、物理或化學(xué)連接的化合物、蛋白質(zhì)、或核酸類(lèi)分子，帶過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞漿，胞核內(nèi)，甚至BBB，發(fā)揮各自的生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)域。精品參考文獻(xiàn)資料優(yōu)秀畢業(yè)論文摘要PTD／TAT介導(dǎo)的蛋白質(zhì)可穿過(guò)由腦血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的BBB，使所攜帶蛋白進(jìn)入大腦發(fā)揮生理作用，而使一些在正常情況下是不能通過(guò)BBB的蛋白進(jìn)入腦組細(xì)：，／、o本實(shí)驗(yàn)中心前期通過(guò)基因工程的方法成功制備了編碼成熟BDNF—TAT融合蛋白的基因，目的在于在世界上首先制備一種能通過(guò)BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，治療神經(jīng)退行性疾病的基因重組神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子藥物制劑。基于前期研究，本文
5、采用重組質(zhì)粒PET-30(a)．BDNF．TAT轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)plysS中優(yōu)化表達(dá)，經(jīng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂優(yōu)化純化及精氨酸倍比稀釋法復(fù)性BDNF．TAT融合蛋白，尾靜脈給藥KM種小鼠后研究其腦靶向性及其在腦組織中的分布，體外培養(yǎng)SD大鼠新生一周鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元檢測(cè)BDNF．TAT融合蛋白的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步研究可透過(guò)血腦屏障藥物BDNF．TAT融合蛋白治療神經(jīng)退行性疾病提供物質(zhì)基礎(chǔ)。目的1．研究重組質(zhì)粒PET-30(a)-BDNF-TAT轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL2l(DE3)plysS后BDNF．TA
6、T融合蛋白的表達(dá)，并優(yōu)化BDNF．TAT融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)及純化的條件；2．小鼠經(jīng)尾靜脈血管給予復(fù)性后BDNF．TAT融合蛋白，探討其在小鼠腦組織中的腦靶向性及在小鼠腦組織【}I的分布；3．體外培養(yǎng)新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞，進(jìn)一步研究復(fù)性后BDNF．TAT融合蛋白體外促進(jìn)神經(jīng)元存活生長(zhǎng)的活性。方法1．根據(jù)前期課題組經(jīng)基因工程辦法制備的重組質(zhì)粒PET-30(a)．BDNF．TAT及，本文將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL2l(DE3)plysS，37"C，1．0mMIPTG誘導(dǎo)4h后低溫離心(4℃，5000
7、rpm)收集菌體，超聲裂解，高速離心后收集各步驟樣品，通過(guò)15％SDS．PAGE和WesternBlot分析確定融合蛋白BDNF．TAT在大腸桿菌中的表達(dá)形式；分別選取25"C、30"12、33"C、37‘C、40"C為不同的Ⅱ精品參考文獻(xiàn)資料優(yōu)秀畢業(yè)論文碩士學(xué)位論文誘導(dǎo)溫度，對(duì)誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化；分別選取0．1mM、0．5mM、1．0mM、1．SmM為IPTG誘導(dǎo)濃度，對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度經(jīng)行優(yōu)化；選取l、2、4、6、8為誘導(dǎo)時(shí)間，對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間經(jīng)行優(yōu)化；收集各條件下大腸桿菌并經(jīng)行15％SDS．PAGE和Wester
8、nBlot分析確定BDNF．TAT融合蛋白在大腸桿菌中的最佳表達(dá)條件。2．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后，經(jīng)25℃，0．5mMIPTG誘導(dǎo)4h后離心收集濕菌體，PBS重懸洗滌后用60％強(qiáng)度超聲破碎儀裂解大腸桿菌，4"C、12000rpm低溫高速高速離心去上清，沉淀用2M尿素和0．4％DOC洗滌并重復(fù)洗滌一次，低溫高速離心去上清，包涵體沉淀用8M尿素4。C攪拌溶解14h，溶解后蛋白通過(guò)中高壓層
