人血管形成素在大腸桿菌中的融合表達(dá)、純化及活性測(cè)定

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1、!"卷!期生物工程學(xué)報(bào)%&’(!")&(!#$$!年!月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12*&+,-./#$$!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!人血管形成素在大腸桿菌中的融合表達(dá)、純化及活性測(cè)定楊輝!"張英起!顏真!韓葦!藥立波#蘇成芝#（!第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心，#第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室西安"!$$7#）摘要@40AB@獲取的血管形成素C+D;&D5+;+?E)C片段，克隆入融合表達(dá)載體F@G94H中，表達(dá)產(chǎn)物為)端融合了I;J2的融合蛋白，以包

2、涵體形式存在，占菌體總蛋白的!$K。用3:&’／L脲溶解包涵體，利用I;J2與過渡態(tài)金屬離子);#M高親合力結(jié)合的性質(zhì)，經(jīng));#M0)4C親和樹脂一步法純化，獲得純度達(dá)63K以上I;J20C)N融合蛋白，O5JP5.+0<’&P結(jié)果表明在相應(yīng)分子量處有一條特異性條帶。重組蛋白復(fù)性后活性測(cè)定表明，在體外可促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜（BCQ）血管形成，并可降解P@)C。關(guān)鍵詞血管形成素，I;J2融合蛋白，配體親和層析中圖分類號(hào)@7!3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼C文章編號(hào)!$$$07$2!（#$$!）$!0$$880$1腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有賴于新生血管的不斷形成，SA4N、10氯乙萘酚為上海生工產(chǎn)品；);#M0)

3、4C人們一直尋找來自腫瘤細(xì)胞的介導(dǎo)血管生長(zhǎng)的物G5FR-.&J52H為U;-D5+產(chǎn)品；山羊抗人C)N多抗、質(zhì)，希望其能成為新的腫瘤治療藥物，從而控制腫瘤及辣根酶標(biāo)記的鼠抗羊的二抗為G-+P-B.,V和北京生長(zhǎng)［!］。!638年，首次從人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系I40#6中山公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)了一種能誘導(dǎo)血管形成的物!"$%&’重組質(zhì)，命名為C+D;&D5+;+（血管形成素，簡(jiǎn)稱C)N）［#］。質(zhì)粒提取，酶切反應(yīng)，E)C電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化參照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行［1］。RC)N的發(fā)現(xiàn)引起人們極大的興趣，但從人結(jié)腸腺癌I40#6細(xì)胞條件培養(yǎng)基中獲取RC)N的量，不足!"(外源基因

4、表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物溶解性分析以供RC)N生理功能、抗原特性及潛在的臨床應(yīng)用構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒F@G940C)N轉(zhuǎn)化宿等方面的研究應(yīng)用，為獲取足夠量的RC)N，我們將主菌HL#!E97（FL/GJ），挑取單克隆即為C)N的表RC)N?E)C克隆入帶有純化標(biāo)簽的表達(dá)載體達(dá)菌株，接種于含C:F（!$$#D／:L）的LH中，次日［7］，便晨，按#K轉(zhuǎn)接，7"W培養(yǎng)7R，加SA4N至終濃度F@G94H，表達(dá)的目的蛋白的)端融合有I;J2于利用金屬鏊合親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物一步純化，$X8::&’／L，誘導(dǎo)表達(dá)!$8R，!#KGEG0ACN9，電獲得有活性的重組蛋白，為探索腫瘤發(fā)生、發(fā)展中腫泳，

5、以鑒定是否有誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)。瘤血管形成的意義、機(jī)制及相應(yīng)的拮抗劑的研究打誘導(dǎo)表達(dá)菌懸于G49中，加入溶菌酶，1K下基礎(chǔ)。ETB，#::&’／LQDB’#，E)-J5%，攪拌片刻，1W下!#$$$.／:;+離心!$:;+，分別取上清和沉淀進(jìn)行!材料與方法!#KGEG0ACN9。!"!材料!")表達(dá)產(chǎn)物的親和純化菌種和質(zhì)粒：表達(dá).RC)N的重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)菌!D，冰浴，懸于8:L緩沖液H［7］，質(zhì)粒F@G94H含（3:&’／L脲，$X!:&’／L)-I，$($!:&’／L4.;J(B’F@G940C)N由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建#AT1有4"啟動(dòng)子的融合表達(dá)載體，340(,#HL#!（E97）FI3

6、($），攪拌至清亮，!$$$$DY7$:;+離心，上清FL/GJ含有"溶原的4"@)C聚合酶基因的表達(dá)宿即為細(xì)菌裂解液，與!:L預(yù)先用緩沖液H平衡的主菌。);#M0)4C樹脂混合裝柱。依次用#Y1:L緩沖液!"#酶和試劑B（3:&’／L脲，$X$!:&’／L)-I#AT1，$X$!:&’／L限制酶，41E)C’;D-J5為NSHBT公司產(chǎn)品；4.;J(B’FI2X7）洗去非特異吸附蛋白，1Y$X8:L收稿日期：#$$$0$10#2，修回日期：#$$$0$30#3。"聯(lián)系作者。45’：320#6077"18"7；90:-;’：<;&"$"!=::,(5>,(?+生物工程學(xué)報(bào))G卷8<

7、緩沖液!（"#$%／&脲，’()#$%／&*+,-./0，’1’)顯示，誘導(dǎo)者在分子量)"V!處有一條明顯的深染#$%／&234516%7,819）及0:’18#&緩沖液;（"新生蛋白帶，與預(yù)計(jì),45后有一明顯的重組蛋白表達(dá)6%7,018），洗脫特異性結(jié)合的,45<融合蛋白，收集條帶（J4O1)）。誘導(dǎo)表達(dá)菌，裂菌，上清和沉淀行洗脫峰。!、;洗脫峰用