人胸腺肽β4基因在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及促血管生成生物活性研究

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1、人胸腺肽β4基因在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及促血管生成生物活性研究【摘要】目的：在大腸桿菌中克隆和表達(dá)人源胸腺肽（thymosinβ4，TB4）基因并進(jìn)行分離純化及促血管生成生物活性鑒定。方法：人工設(shè)計(jì)TB4基因片段，其密碼子為大腸桿菌所偏愛，將合成的寡核苷酸片段經(jīng)分子克隆拼接成TB4基因片段，與pET28a(+)載體連接成重組表達(dá)質(zhì)粒pET28aTB4，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)帶His6Tag的融合蛋白His6TB4，通過鎳柱親和層析純化，采用SDSPAGE分析鑒定，由CAM試驗(yàn)進(jìn)行重組蛋白活性的生物

2、活性鑒定。結(jié)果：經(jīng)DNA序列分析鑒定，重組質(zhì)粒pET28aTB4構(gòu)建成功，IPTG誘導(dǎo)后的融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，并經(jīng)一步鎳柱親和層析即獲得純化。CAM試驗(yàn)證明其有促進(jìn)毛細(xì)血管生成的活性。結(jié)論：獲得高效表達(dá)的、高純度的His6TB4融合蛋白，為TB4的進(jìn)一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】人胸腺肽β4表達(dá)鎳柱純化雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)胸腺肽β4（thymosinβ4,TB4）是從胸腺素組分5（F5）中分離得到的，是生物體內(nèi)豐度最高且高度保守的一種βthymosin。它不僅存在于胸腺中，還存在機(jī)體眾

3、多組織中，在參與調(diào)節(jié)免疫及細(xì)胞生理活動(dòng)等一系列過程中呈現(xiàn)功能多樣性，因此引起了研究者的廣泛關(guān)注[12]。TB4是由43個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，相對分子質(zhì)量約5000，等電點(diǎn)5.1，以前多認(rèn)為其定位于細(xì)胞漿中，目前有報(bào)道說它也有細(xì)胞核的定位[3]。最近報(bào)道表明，TB4可以促進(jìn)毛細(xì)血管生成和創(chuàng)傷愈合，降低炎癥反應(yīng)，抑制一些上皮細(xì)胞的凋亡，在醫(yī)學(xué)治療疾病中大有潛力[46]。本研究設(shè)計(jì)并合成TB4的編碼基因，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)它的高效表達(dá)，進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行其促毛細(xì)血管生成活性初步鑒定，旨在為今后對TB4蛋白功能的進(jìn)一步研究和藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。1材

4、料和方法1.1試劑、質(zhì)粒及菌株pET28a(+)質(zhì)粒、大腸桿菌Top10、BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；PCR試劑、限制性內(nèi)切酶、Klenoical公司；NiIDA填料由本實(shí)驗(yàn)室提供。1.2方法1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.2.1.1TB4目的基因片段的獲得TB4基因序列于NCBI數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性，對其進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷摹ＴO(shè)計(jì)5個(gè)基因片段，由上海英駿（Invitrogen）公司合成。1.2.1.2TB4基因的拼接將合成的基因片段1（5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAA

5、ATCCAAACTGAAG3′）和基因片段2（5′TTTGGACGGCAGCGGGTTTTTTTCCTGAGTTTCAGTCTTCTTCAGTTTGGATTT3′）退火，利用Klenoin；95℃變性40s，58℃復(fù)性40s，72℃延伸40s,循環(huán)28次；末次延伸為72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠純化試劑盒純化。圖1TB4目的基因合成過程示意圖1.2.1.4pET28aTB4重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測序鑒定將純化后得到的TB4基因片段用NdeI和SacI雙酶切，用T4連接酶連接于已同樣酶切的pET28a(+)質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)

6、化大腸桿菌Top10，卡那霉素抗性板篩選陽性克隆，挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定為陽性的克隆送上海英駿（Invitrogen）公司測序鑒定。1.2.2融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將重組質(zhì)粒pET28aTB4轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，挑單克隆于1L含卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中37℃搖菌培養(yǎng)，當(dāng)其A600達(dá)到0.8時(shí)，加入終濃度為1mmol·L-1IPTG，誘導(dǎo)35h；離心收獲菌體，進(jìn)行SDSPAGE分析。將表達(dá)菌體重懸于60mlBufferB（0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.01

7、mol·L-1imidazole,pH8.0），進(jìn)行超聲破碎細(xì)菌，然后離心取上清，上樣由BufferB平衡過的NiIDA親和層析柱，再用BufferC（0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.05mol·L-1imidazole,pH8.0）洗層析柱去除雜蛋白，最后通過BufferD（0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.25mol·L-1imidazole,pH8.0）洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。1.2.3雞胚尿囊膜血管生成實(shí)驗(yàn)（choriollantoicmembraneassa

8、y，CAM實(shí)驗(yàn)）我們用CAM模型檢測His6TB4對體內(nèi)血管生成的作用[7８]。取材孵育7d的活受精雞胚，在蛋殼上開窗暴露尿囊膜，將滅菌圓形濾紙片