人胸腺肽β4基因在大腸桿菌中的克隆、表達、純化及促血管生成生物活性研究

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時間:2018-05-07

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1、人胸腺肽β4基因在大腸桿菌中的克隆、表達、純化及促血管生成生物活性研究【摘要】目的:在大腸桿菌中克隆和表達人源胸腺肽(thymosinβ4,TB4)基因并進行分離純化及促血管生成生物活性鑒定。方法:人工設計TB4基因片段,其密碼子為大腸桿菌所偏愛,將合成的寡核苷酸片段經分子克隆拼接成TB4基因片段,與pET28a(+)載體連接成重組表達質粒pET28aTB4,將其轉化大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導表達帶His6Tag的融合蛋白His6TB4,通過鎳柱親和層析純化,采用SDSPAGE分析鑒定,由CAM試驗進行重組蛋白活性的生物

2、活性鑒定。結果:經DNA序列分析鑒定,重組質粒pET28aTB4構建成功,IPTG誘導后的融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中得到高效表達,并經一步鎳柱親和層析即獲得純化。CAM試驗證明其有促進毛細血管生成的活性。結論:獲得高效表達的、高純度的His6TB4融合蛋白,為TB4的進一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了基礎。【關鍵詞】人胸腺肽β4表達鎳柱純化雞胚尿囊膜實驗胸腺肽β4(thymosinβ4,TB4)是從胸腺素組分5(F5)中分離得到的,是生物體內豐度最高且高度保守的一種βthymosin。它不僅存在于胸腺中,還存在機體眾

3、多組織中,在參與調節(jié)免疫及細胞生理活動等一系列過程中呈現(xiàn)功能多樣性,因此引起了研究者的廣泛關注[12]。TB4是由43個氨基酸殘基組成的多肽,相對分子質量約5000,等電點5.1,以前多認為其定位于細胞漿中,目前有報道說它也有細胞核的定位[3]。最近報道表明,TB4可以促進毛細血管生成和創(chuàng)傷愈合,降低炎癥反應,抑制一些上皮細胞的凋亡,在醫(yī)學治療疾病中大有潛力[46]。本研究設計并合成TB4的編碼基因,在大腸桿菌中實現(xiàn)它的高效表達,進行分離純化,并進行其促毛細血管生成活性初步鑒定,旨在為今后對TB4蛋白功能的進一步研究和藥物開發(fā)打下基礎。1材

4、料和方法1.1試劑、質粒及菌株pET28a(+)質粒、大腸桿菌Top10、BL21(DE3)由本實驗室保存;PCR試劑、限制性內切酶、Klenoical公司;NiIDA填料由本實驗室提供。1.2方法1.2.1重組質粒的構建1.2.1.1TB4目的基因片段的獲得TB4基因序列于NCBI數(shù)據(jù)庫,并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性,對其進行適當?shù)男薷摹TO計5個基因片段,由上海英駿(Invitrogen)公司合成。1.2.1.2TB4基因的拼接將合成的基因片段1(5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAA

5、ATCCAAACTGAAG3′)和基因片段2(5′TTTGGACGGCAGCGGGTTTTTTTCCTGAGTTTCAGTCTTCTTCAGTTTGGATTT3′)退火,利用Klenoin;95℃變性40s,58℃復性40s,72℃延伸40s,循環(huán)28次;末次延伸為72℃10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠純化試劑盒純化。圖1TB4目的基因合成過程示意圖1.2.1.4pET28aTB4重組質粒的構建與測序鑒定將純化后得到的TB4基因片段用NdeI和SacI雙酶切,用T4連接酶連接于已同樣酶切的pET28a(+)質粒中,再轉

6、化大腸桿菌Top10,卡那霉素抗性板篩選陽性克隆,挑單菌落進行PCR鑒定為陽性的克隆送上海英駿(Invitrogen)公司測序鑒定。1.2.2融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中的誘導表達和純化將重組質粒pET28aTB4轉化BL21(DE3)大腸桿菌,挑單克隆于1L含卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中37℃搖菌培養(yǎng),當其A600達到0.8時,加入終濃度為1mmol·L-1IPTG,誘導35h;離心收獲菌體,進行SDSPAGE分析。將表達菌體重懸于60mlBufferB(0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.01

7、mol·L-1imidazole,pH8.0),進行超聲破碎細菌,然后離心取上清,上樣由BufferB平衡過的NiIDA親和層析柱,再用BufferC(0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.05mol·L-1imidazole,pH8.0)洗層析柱去除雜蛋白,最后通過BufferD(0.05mol·L-1Na3PO4,0.3mol·L-1NaCl,0.25mol·L-1imidazole,pH8.0)洗脫,收集目的蛋白洗脫峰。1.2.3雞胚尿囊膜血管生成實驗(choriollantoicmembraneassa

8、y,CAM實驗)我們用CAM模型檢測His6TB4對體內血管生成的作用[78]。取材孵育7d的活受精雞胚,在蛋殼上開窗暴露尿囊膜,將滅菌圓形濾紙片

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