人轉(zhuǎn)錄因子usf基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及在

《人轉(zhuǎn)錄因子usf基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及在》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、人轉(zhuǎn)錄因子USF基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及在【摘要】目的：在大腸桿菌中表達(dá)人源轉(zhuǎn)錄因子USF（upstreamstimulatoryfactor）并進(jìn)行分離純化，進(jìn)一步分析其在FAK(focaladhesionkinase)啟動(dòng)子中的DNA結(jié)合能力。方法：將人源USFcDNA克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET28a載體，然后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)帶His6Tag的融合蛋白HisUSF，通過鎳柱親和層析純化，SDSPAGE分析鑒定。EMSA分析純化后的蛋白與FAK啟動(dòng)子的DNA結(jié)合情況。結(jié)果：HisUSF在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，鎳柱親和層析

2、純化得到了高純度的蛋白，并能夠結(jié)合到FAK的啟動(dòng)子上。結(jié)論：獲得高效表達(dá)的高純度HisUSF融合蛋白，為USF對其靶基因的結(jié)合與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】USF基因粘著斑激酶蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子許多重要的細(xì)胞活動(dòng)是由bHLH類型（basichelixloophelix）的轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的,USF(upstreamstimulatoryfactor)就是這種類型的重要的轉(zhuǎn)錄因子。它含有helixloophelix結(jié)構(gòu)域,以二聚化的形式結(jié)合到靶基因的調(diào)控區(qū)，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[1]。它在靶基因上結(jié)合位點(diǎn)含有CACGTGEbox結(jié)構(gòu)。USF最初是作為腺病毒晚期啟動(dòng)子

3、的反式激活因子而被發(fā)現(xiàn)的[1]，后來的研究證明USF在組織中的分布很廣泛[23]，許多的細(xì)胞基因也受到其調(diào)控[48]。受其調(diào)控的靶基因多是和細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖等相關(guān)的基因[47]及對壓力刺激反應(yīng)的基因[8]。USF在一些腫瘤中的表達(dá)水平明顯異常[9]。為了研究USF在FAK(focaladhesionkinase)基因調(diào)控中的作用，我們首先用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得USF蛋白，并初步分析其在FAK基因啟動(dòng)子中的結(jié)合能力。1材料與方法1.1材料pET28a、大腸桿菌Top10、BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存。含有人USFcDNA的質(zhì)粒pRK5huUSF由Philip

4、pePognonec贈(zèng)送（InstituteofSignaling,DevelopmentalBiologyandCancerResearch,ParcValrose,06108Nicecedex2,France）。PCR試劑、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、T4多聚核苷酸激酶等購自TaKaRa公司，IPTG購自華美生物公司，3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒購自申能博彩生物科技有限公司，NiIDA填料購自Phamarcia公司，ProbeQuantTMG50微型離心柱購自安瑪西亞，32PdATP購自北京福瑞公司。1.2方法1.2.1重組質(zhì)粒的克隆首先，按照USF編碼序列

5、設(shè)計(jì)引物，USFcDNA擴(kuò)增引物如下：USF上游引物（含EcoRI位點(diǎn)）5′CCGGAATTCATGAAGGGGCAGCAGAAAACAGC3′，USF下游引物（含HindⅢ）5′GTCCCAAGCTTTTAGTTGCTGTCATTCTTGATGAC3′，擴(kuò)增的cDNA大小為933bp，USFcDNA編碼310個(gè)氨基酸。PCR產(chǎn)物純化回收后，經(jīng)EcoRI和HindⅢ雙酶切，用T4連接酶連接到同樣酶切回收的pET28a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，卡那霉素抗性板篩選陽性克隆，經(jīng)酶切鑒定后送上海英俊（Invitrogen）公司測序。1.2.2融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

6、和純化將重組質(zhì)粒pET28aUSF轉(zhuǎn)化BL21（DE3）大腸桿菌，挑單克隆于1L有卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中37℃搖菌培養(yǎng)，當(dāng)其A260約達(dá)到0.8時(shí)，加入終濃度為1mmol·L-1IPTG，誘導(dǎo)35h，收獲菌體，進(jìn)行SDSPAGE分析。將表達(dá)菌體重懸于60mlBufferB（50mmol·L-1Na3PO4，300mmol·L-1NaCl，10mmol·L-1imidazole，pH8.0），超聲破碎，離心取上清，NiIDA親和層析柱由BufferB平衡過后上樣,再用BufferC（50mmol·L-1Na3PO4，300mmol·L-1NaCl，50mmol·L-1

7、imidazole，pH8.0）洗去雜蛋白，最后通過BufferD（50mmol·L-1Na3PO4，300mmol·L-1NaCl，250mmol·L-1imidazole，pH8.0）洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。1.2.3細(xì)胞核抽提根據(jù)文獻(xiàn)[10]抽提3T3細(xì)胞核蛋白，PBS洗滌3T3細(xì)胞2次，然后用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，重懸于Buffer1（10mmol·L-1HEPES,pH7.9,10mmol·L-1KCl,1.5mmol·L-1MgCl2,0.1mmol·L-1EGTA,0.