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《內(nèi)源性血管生成抑制因子arresten基因的克隆、表達(dá)、純化及活性的測定》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文內(nèi)源性血管生成抑制因子Arresten基因的克隆、表達(dá)、純化及活性的測定姓名：唐海英申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：衛(wèi)生毒理學(xué)指導(dǎo)教師：鄭金平20060516一曼，一!里墮墮翌查堂塑±堂些簍苧內(nèi)源性血管生成抑制因子Arresten基因的克隆、表達(dá)、純化及活性的測定摘要目的：構(gòu)建內(nèi)源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表達(dá)載體，優(yōu)化表達(dá)條件，初步探討表達(dá)蛋白的抑制血管活性。方法：從GenBank庫中查找Arresten基因并獲取其基因序列及蛋白序列，用DNAman軟件設(shè)計引物。從健康產(chǎn)婦胎盤組織中提取
2、人總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出Arresten基因，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收純化，純化產(chǎn)物和質(zhì)粒pBV220連接，并轉(zhuǎn)化EcD『fJMl09、DH5a、BL21、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐陽性平板中篩選陽性菌落。重組質(zhì)粒用PCR法和三種限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI和PvuII(基因序列155位的酶切位點(diǎn))酶切進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行序列測定，命名為pBV220．Art。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBV220．Art轉(zhuǎn)化到宿主菌——EcoliJMl09、DH5a、BL2l、BL2l(DE3)中進(jìn)
3、行原核表達(dá)。經(jīng)SDS．PAGE凝膠電泳圖條帶分析，并結(jié)合濕菌重篩選出最優(yōu)表達(dá)菌種，進(jìn)行培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時問、表達(dá)溫度、表達(dá)時間及溶解氧量五方面表達(dá)，確定最優(yōu)表達(dá)體系；超聲破菌，分離得到包涵體，并對其進(jìn)行洗滌純化復(fù)性，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量；雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)觀察新生血管生長抑制情況。結(jié)果：成功篩選出Axresten基因，通過測序結(jié)果表明在第132、148、200、236位基因序列不同；通過成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBV220．Air，在EcoliJMl09、DH5a、BL21、BL21(DE3)中均表達(dá)出Arresten蛋白，S
4、DS-PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物分子量約為26KD，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在：通過優(yōu)化表達(dá)，結(jié)果在E∞矗BL21(DE3)中30℃培養(yǎng)4h，42℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，溶解氧量比例在1：5時表達(dá)量達(dá)到最高，表達(dá)量約占全菌蛋白的25％以上：進(jìn)一步純化表達(dá)，用2mol／L尿素、2％的TritonX-100溶液和1M的蔗糖溶液，及少許的EDTA洗滌效果最好，表達(dá)量約占全菌蛋白的40％以上，用梯度稀釋法復(fù)性得到Arresten蛋白：經(jīng)活性分析證實(shí)初步復(fù)性的A_rresten蛋白與陰性對照組比較統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異，證明其有抑制新生血管生成的
5、作用。結(jié)論：應(yīng)用基因工程技術(shù)，成功篩選出Arresten基因，并構(gòu)建了原核表達(dá)重組體pBV220．Arr；通過優(yōu)化表達(dá)，得到最優(yōu)表達(dá)菌種coliBL21(DE3)及最優(yōu)表達(dá)條件，能高效表達(dá)重組AiTesten蛋白；經(jīng)過用尿素與Tritonx．100及蔗糖溶液綜合方法洗滌純化，純化效果最好并獲得了較純的AiTesten蛋白；經(jīng)過CAM試驗(yàn)證明，該蛋白具有良好的抑制新生血管生成的活性：Arresten蛋白具有良好的應(yīng)用前景，通過對mrresten蛋白的研究，為進(jìn)一步大規(guī)模高效表達(dá)和純化AITCStcn目的蛋白提供了可靠的實(shí)驗(yàn)方
6、法，也為腫瘤的基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：Arresten，原核表達(dá)載體，基因克隆表達(dá)，功能測定山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文Cloning，expression，purificationofendogenousangiogenesisinhibitorArrestengeneanditsbiologicalactivitydetectionAbstractobjecfive：Inordertoconstructprokaryoticexpressionvectorforendogeneticangiogenesisinhi
7、bitorArrestengeneandtooptimizetheexpressioncondition，inthesametimetoinvestigateinitiallytheanti·bloodvesselactivityoftheexpressingprotein．Methods：AccordingtothemRNAsequenceandproteinsequenceofArrestengenefromtheGenbank，specificprimersforPCRweredesignedbyusingtheso
8、ftwareDNAman．ThetotalRNAwasextractedfromahealthypuerpera’Splacentaorganizeofthenormalpuerperal，andhumanArrestengenewasamplifiedbyreversetranscription·po
