血管生成抑制因子arresten的真核表達體系的

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1、血管生成抑制因子arresten的真核表達體系的【摘要】目的構(gòu)建血管生成抑制因子arresten的真核表達細胞克隆體系。方法用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，通過真核表達載體pSecTag2arresten將arresten基因?qū)隒HO細胞，經(jīng)抗生素Zeocin篩選獲得陽性細胞克隆，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測arrestenmRNA表達，免疫蛋白印跡技術(shù)(EM無血清培養(yǎng)基的CHO細胞中，6h后將培養(yǎng)液換為含血清的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.2.2陽性克隆的篩選轉(zhuǎn)染后的第24h，將培養(yǎng)板中的細胞按1∶10比例分散培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后的第48h開始加抗生素Zeocin進行篩選，篩選濃

2、度為130μg/ml，出現(xiàn)陽性克隆后，100μg/ml維持篩選約15d。1.2.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測轉(zhuǎn)染的arresten基因的mRNA表達根據(jù)已知的arresten基因序列，使用Primer5引物設(shè)計軟件設(shè)計引物,引物由上海生工工程有限公司成。上游引物序列P1為：GTCAGGATCCTCTGTTGATCACGGCTTC，下游引物序列P2為GGGCAAGCTTTGTTCTTCTCATACAGAC；內(nèi)參照物βactin上游引物序列βactin1為CTCCGCAGGGTGTGATGGTG；下游引物序列βactin2為AGAAGGGCGTGC

3、TGAGAAGTTGA。arresten、Bactin的擴增片斷分別為711bp和307bp。采用一步法行RTPCR，反應(yīng)體系：RnaseFreeH2O19μl,5χReactionBuffer10μl,2.5mMdNTPs6μl,25mMMn(Oac)2μl,P12μl,P22μl,βactin12μl,βactin22μl,10u/μlRnase抑制劑2μl,2.5u/μlrTthDNApolymerase2μl,總RNA2μl。反應(yīng)條件：60℃,30min；94℃,2min；94℃,10min，60℃,1.5min,共40次循環(huán)；最后，60℃延伸7

4、min。產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。1.2.4免疫印跡技術(shù)（：marker；1:轉(zhuǎn)染pSecTag2arresten組;2:轉(zhuǎn)染pSecTag2組;3:未轉(zhuǎn)染的空白對照組圖1轉(zhuǎn)染基因的RTPCR鑒定2.3真核arresten蛋白的表達an提出了“腫瘤的生長必須依賴血管”的著名論點，并逐漸被人們所接受。從那時起，抑制血管生成是抗腫瘤治療研究的熱點。近年來，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)專家研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管是腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，腫瘤血管除向腫瘤細胞提供營養(yǎng)外，還不斷地向人體其他部位輸送腫瘤細胞，導(dǎo)致惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。因此，抑制血管生成是有效的抑制腫瘤細胞生長也轉(zhuǎn)移的的手

5、段。目前，血管生成抑制劑的研究主要有如下4種策略：(1)阻斷內(nèi)皮細胞降解周圍基質(zhì)的能力；(2)直接抑制內(nèi)皮細胞的功能；(3)阻斷血管生成因子的合成和釋放，拮抗其作用；(4)阻斷內(nèi)皮細胞表面整合素的作用[2]。arresten是Colorado等在2000年發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子，該因子能夠抑制裸鼠移植瘤的生長。arresten與內(nèi)皮抑素同為來自膠原蛋白的血管生成抑制因子，但與內(nèi)皮抑素endostatin一樣無任何毒副作用，而且它還有arresten自身的優(yōu)點，它是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，能夠有效的保持其活性，而內(nèi)皮抑素因其蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定可能限制其使用，更重要的是，arre

6、sten抑制裸鼠移植瘤生長的效果均強于內(nèi)皮抑素[1]。然而arresten確切的抑制血管生成的具體途徑及其相關(guān)機制目前并不清楚，而獲得該因子是深入進行arresten相關(guān)研究的前提。我們在先前研究已經(jīng)在國內(nèi)首先獲得原核表達的arresten蛋白[3]，原核表達雖產(chǎn)量高，但產(chǎn)物的復(fù)性差、活性低，我們用原核表達的arresten進行的相關(guān)實驗也未得到理想的結(jié)果。而CHO細胞是目前較常用的真核表達體系，它可較長時間地表達所攜帶的基因而不衰減,并能穩(wěn)定地大量表達，其表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有糖基化、磷酸化等修飾，具有良好的生物學(xué)活性，因此被廣泛用于蛋白表達和疫苗生產(chǎn)。我們通過脂質(zhì)

7、體轉(zhuǎn)染方法行將arresten基因?qū)隒HO細胞，經(jīng)抗生素Zeocin篩選獲得了陽性克隆細胞，隨后進行的RTPCR證實我們成功在CHO細胞中導(dǎo)入arresten基因，并通過phausG,etal.antiangiogeniccuesfromvascularbasementmembranecollagen[J].CancerRes,2000,60（11）:25202526.［2］HanahanD,FolkmanJ.Patternsandemergingmechanismsoftheangiogenicsorigenesis[J].Cell，1996,