人胸腺肽β4基因在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及促血管生成生物活性研究.doc

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1、人胸腺肽β4基因在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及促血管生成生物活性研究【摘要】目的：在大腸桿菌中克隆和表達(dá)人源胸腺肽（thymosinβ4，TB4）基因并進(jìn)行分離純化及促血管生成生物活性鑒定。方法：人工設(shè)計(jì)TB4基因片段，其密碼子為大腸桿菌所偏愛，將合成的寡核苷酸片段經(jīng)分子克隆拼接成TB4基因片段，與pET28a(+)載體連接成重組表達(dá)質(zhì)粒pET28aTB4，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)帶His6Tag的融合蛋白His6TB4，通過(guò)鎳柱親和層析純化，采用SDSP

2、AGE分析鑒定，由CAM試驗(yàn)進(jìn)行重組蛋白活性的生物活性鑒定。結(jié)果：經(jīng)DNA序列分析鑒定，重組質(zhì)粒pET28aTB4構(gòu)建成功，IPTG誘導(dǎo)后的融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，并經(jīng)一步鎳柱親和層析即獲得純化。CAM試驗(yàn)證明其有促進(jìn)毛細(xì)血管生成的活性。結(jié)論：獲得高效表達(dá)的、高純度的His6TB4融合蛋白，為TB4的進(jìn)一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】人胸腺肽β4表達(dá)鎳柱純化雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)胸腺肽β4（thymosinβ4,TB4）是從胸腺素組分5（F5）中

3、分離得到的，是生物體內(nèi)豐度最高且高度保守的一種βthymosin。它不僅存在于胸腺中，還存在機(jī)體眾多組織中，在參與調(diào)節(jié)免疫及細(xì)胞生理活動(dòng)等一系列過(guò)程中呈現(xiàn)功能多樣性，因此引起了研究者的廣泛關(guān)注[12]。TB4是由43個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，相對(duì)分子質(zhì)量約5000，等電點(diǎn)5.1，以前多認(rèn)為其定位于細(xì)胞漿中，目前有報(bào)道說(shuō)它也有細(xì)胞核的定位[3]。最近報(bào)道表明，TB4可以促進(jìn)毛細(xì)血管生成和創(chuàng)傷愈合，降低炎癥反應(yīng)，抑制一些上皮細(xì)胞的凋亡，在醫(yī)學(xué)治療疾病中大有潛力[46]。本研究設(shè)計(jì)并合成TB4的編

4、碼基因，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)它的高效表達(dá)，進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行其促毛細(xì)血管生成活性初步鑒定，旨在為今后對(duì)TB4蛋白功能的進(jìn)一步研究和藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試劑、質(zhì)粒及菌株pET28a(+)質(zhì)粒、大腸桿菌Top10、BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；PCR試劑、限制性內(nèi)切酶、Klenow酶、T4連接酶等酶類購(gòu)自大連TaKaRa公司；IPTG購(gòu)自華美生物工程公司；3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司；MicroBCAKit購(gòu)自PIERCEChemic

5、al公司；NiIDA填料由本實(shí)驗(yàn)室提供。1.2方法1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建51.2.1.1TB4目的基因片段的獲得TB4基因序列來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，并根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷摹ＴO(shè)計(jì)5個(gè)基因片段，由上海英駿（Invitrogen）公司合成。1.2.1.2TB4基因的拼接將合成的基因片段1（5′ATGTCTGACAAACCGGACATGGCTGAAATCGAAAAATTCGACAAATCCAAACTGAAG3′）和基因片段2（5′TTTGGACGGCAGCGGGTTTT

6、TTTCCTGAGTTTCAGTCTTCTTCAGTTTGGATTT3′）退火，利用Klenow酶延伸補(bǔ)平；相同的方法將基因片段3（5′AACCCGCTGCCGTCCAAAGAAACTATCGAACAGGAAAAACAGGCTGGTGAATCCTAG3′）和基因片段4（5′GGCGAGCTCTAGGATTCACCAGCCTG3′）退火補(bǔ)平。兩次退火得到2個(gè)DNA大片段（A和B），將DNA大片段A和B退火延伸即得到TB4基因。1.2.1.3PCR擴(kuò)增TB4基因以退火得到的TB4基因?yàn)槟０?/p>

7、，基因片段5（5′GGAATTCCATATGGACGACGACGACAAGATGTCTGACAAACCGGAC3′）和基因片段4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1）。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性40s，58℃復(fù)性40s，72℃延伸40s,循環(huán)28次；末次延伸為72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠純化試劑盒純化。圖1TB4目的基因合成過(guò)程示意圖1.2.1.4pET28aTB4重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序鑒定將純化后得到的TB4基因片段用NdeI和SacI雙酶切，用T

8、4連接酶連接于已同樣酶切的pET28a(+)質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，卡那霉素抗性板篩選陽(yáng)性克隆，挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆送上海英駿（Invitrogen）公司測(cè)序鑒定。1.2.2融合蛋白His6TB4在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將重組質(zhì)粒pET28aTB4轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，挑單克隆于1L含卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中37℃搖菌培養(yǎng)，當(dāng)其A600達(dá)到0.8時(shí)，加入終濃度為1mmol·L-1IPTG，誘導(dǎo)35h；離心收獲菌體，進(jìn)行SDSPAGE分析。將表達(dá)