stnfrⅱ和vip融合蛋白的基因克隆表達、純化及活性檢測

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1、sTNFRⅡ和VIP融合蛋白的基因克隆表達、純化及活性檢測中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2006,26(5):69—73sTNFRlI和VIP融合蛋白的基因克隆表達,純化及活性檢測王虹曾位森陳金華王珊珊劉丹楊艷妮陳百宏李玲(廣州藍星生物科技開發(fā)有限公司廣州510663)摘要可溶性腫瘤壞死因子受體11(sTNFRII)和血管活性腸肽(VIP)對類風濕性關節(jié)炎(RA)均有治療作用,但兩者的作用機制不同.制備兩者融合蛋白,可能具有更好的防治類風濕關節(jié)炎的作用.用含有VIP基因序列的上游引物和sTNFRII的下游引物,用P

2、CR擴增出由連接序列將VIP和sTNFRII基因連接的片段,再亞克隆到原核表達載體pET32a,在大腸桿菌DH5c~內誘導表達.表達的產物經離子交換,疏水層析純化,并用體外中和試驗檢測其抑制TNF細胞毒及肝細胞膜特異性脂蛋白(Lsp)誘導的細胞毒生物活性.結果顯示構建的pET32a—VIP—sTNFRII表達載體在大腸桿菌DH5ct內以包涵體形式表達,疏水層析結合離子交換層析純化后,融合蛋白具有較好的抑制炎癥分子誘導的炎癥反應生物活性,為將來應用打下基礎.關鍵詞sTNFRIIVIP融合蛋白表達純化中圖分類號Q786腫瘤壞死因子受體ii(T

3、NFRII)全長有439個氨基酸,其中胞外區(qū)有234個氨基酸.胞外區(qū)富含Cys重復序列,Cys呈棒狀結構,主要負責與配基結合J.胞外區(qū)在特定的情況下可以脫離下來,形成可溶性受體(SolubeTNFreceptor,sTNFR).sTNFR不介導信號傳遞,但仍能與TNF結合,中和TNF的活性.當sTNFR過量,會與TNFR競爭結合TNF,眾多實驗證明sTNFR在體內,體外能中和TNF誘導的細胞毒性和免疫反應【.美國Immunes公司已研制出sTNFRII—IgGFc融合蛋白,用于治療類風濕病.血管活性腸肽(vasoactiveintesti

4、nalpeptide,VIP)是由28個氨基酸組成的多肽,能在外周淋巴微環(huán)境中產生具有免疫學活性的神經肽.研究表明VIP有抗炎特性,在調節(jié)自身免疫方面發(fā)揮重要作用,成為治療RA極有前景的新藥物J.sTNFRII和VIP對治療類風濕性關節(jié)炎(RA)的作收稿日期:2006-03-06修回日期:2006-04—10通訊作者,電子信箱:laxiwh@263.net用相似,但兩者的作用機制并不相同.本文構建重組質粒,并在大腸桿菌中表達,經離子交換柱純化,獲得有生物活性的融合蛋白VIP-sTNFRII,以期在臨床上有更好的治療效果.l材料和方法1.1

5、材料質粒,菌株和細胞株:人心肌細胞cDNA文庫購自LifeTechnology公司.pET32a,大腸埃希菌DH5ot,小鼠成纖維細胞L929為本實驗室保存.試劑:氧化型谷胱甘肽(GSSG),還原型谷胱甘肽(GSH),精氨酸三羥甲基氨基甲烷(Tris),乙二胺四乙酸(EDTA)均為國產分析純;LB培養(yǎng)基購于Sigma公司;膠回收試劑盒,廣州天為時代公司;T4連接酶,異丙基硫代.B.D.半乳糖苷(IPTG),各種限制性內切酶和MMLV逆轉錄酶,肝細胞膜特異性脂蛋白(Lsp)均購自Promega公司;TNF—a2b標準品購自北京邦定公司;So

6、urce30Q離子交換介質,Phenyl-SepharoseFF疏水介質購于Pharmacia公司.引物合成和DNA測序委托上70中國生物工程雜志ChinaBiotechnologyVo1.26No.52006海invitrogen公司完成.1.2方法1.2.1VIP-sTNFRII融合蛋白基因克隆根據DataBank中的基因序列設計引物,上下游引物5端分別引入酶切位點BamHI和HindIII.上游引物為:5-TCTAGGAATAACTALTCCACTCTGATGCCGTCTFCACAGCACCCGCCTCAGAAAGCAAATGGCT

7、GTGAAGAAATACCTGAACTCCATCCTGAATGcAG6GGGCHGcAG6GGCG4CCGTCGGACTGGAGCTCT-3.下游引物:5'-CCCAAGCTTCAATCAGTCCAACTGGAAG.3.在上游引物中嵌入VIP的開放閱讀框序列84bp(下劃線部分),兩個基因間用一個柔性短肽序列相連(斜體為連接肽序列).用PCR方法以人心肌細胞cDNA文庫為模板擴增sTNFRII基因,并通過上游引物中引入VIP序列,獲得VIP.sTNFRII融合基因.離心沉淀PCR產物,用BamHI和HindlI!雙酶切,l%瓊脂糖凝膠電泳

8、,切下目的條帶(約800bp),DNA凝膠回收試劑盒純化擴增產物.純化的產物與經同樣酶切的pET32a載體_5J混合,T4連接酶連接,構建pET32a-VIP-TNFRII表達質粒,轉化至感受

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