坎氏弧菌tlh溶血素基因的克隆表達(dá)、蛋白純化及活性研究

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1、坎氏弧茵TLH溶獨(dú)創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含未獲得!洼；塑遺查墓絲重要掛別直明的，本欄可空)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：猢、嫡簽字日期：矽／p年4月／oEl學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，并同意以下事項(xiàng)：l、學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論

2、文的復(fù)印件和磁盤，允許論’．文被查閱和借閱。，。：：’：一?！?、學(xué)?？梢詫W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)清華大學(xué)“中國(guó)。學(xué)術(shù)期刊(光盤版)電子雜志社”用于出版和編入CNKI《中國(guó)知識(shí)資源總庫(kù)》，授權(quán)：．。．。：?！袊?guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》。(保．’．密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名：圍、葫導(dǎo)師簽字：睜醍哞1簽字日期：>OlO年牟月矽日簽字日期：柳礦年夠月矽日坎氏弧菌TLH溶血素基因的克隆表達(dá)、蛋白純化及活

3、性研究捅要近年來(lái)，隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖病害呈加重之勢(shì)，成為制約養(yǎng)殖漁業(yè)發(fā)展的首要問(wèn)題之一。在養(yǎng)殖病害種類中以細(xì)菌性病害最為嚴(yán)重，其中又以弧菌屬(Vibrio)的病原菌危害最大?；【『α餍忻鎻V、傳播快、發(fā)病率和死亡率高，因而成為海水養(yǎng)殖病害研究的重點(diǎn)?？彩匣【?Vibriocampbellii)是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧的海洋細(xì)菌，是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的重要條件致病菌，可以引起養(yǎng)殖對(duì)蝦暴發(fā)紅腿病，鮑魚患膿毒敗血癥等，該菌還與螺類和養(yǎng)殖幼魚的發(fā)病相關(guān)，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于對(duì)坎氏弧菌致病性的認(rèn)識(shí)較晚，對(duì)其致病機(jī)理的研究還不夠深入。溶

4、血素是致病弧菌中分布最為廣泛的毒素之一，在病原弧菌的感染過(guò)程中發(fā)揮著多種重要作用。不同病原弧菌產(chǎn)生的溶血素雖然都具有溶血活性，但它們氨基酸序列、溶血活性及作用機(jī)理卻有所不同。前期研究發(fā)現(xiàn)，坎氏弧菌中含有與哈維氏弧菌VHH溶血素基因序列非常相似的TLH溶血素基因，其核苷酸序列與哈維氏弧菌VIB645的vhhA和vhhB的相似性分別為79．81％和79．73％，其氨基酸序列與VHH溶血素相似性為85％，且這兩種溶血素均在147-406位氨基酸處有一個(gè)脂酶結(jié)構(gòu)域(Lipase_GDSL)，推測(cè)這一類溶血素是磷脂酶。本研究克隆表達(dá)了坎氏弧菌的f腑基因，重組表

5、達(dá)后，利用Ni一柱進(jìn)行純化：分析了純化的TLH溶血素的溶血活性以及該溶血素受溫度、pH和金屬離子的影響，并進(jìn)一步研究了TLH溶血素對(duì)斑馬魚的致病性。本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，自坎氏弧菌基因組上擴(kuò)增出tlh溶血素基因(1254bp)：將PCR產(chǎn)物連接到表達(dá)載體pET一26b(+)，構(gòu)建了坎氏弧菌TLH溶血素基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET26b(+)／tlh，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)；加入終濃度為lmM的IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的TLH融合蛋白。誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌及其培養(yǎng)上清液在新鮮牙鲆血平板16。C過(guò)夜及卵磷脂平板37。C過(guò)夜培養(yǎng)

6、，培養(yǎng)結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的菌體及上清液分別具有溶血活性及磷脂酶活性。SDS-PAGE分析顯示，該溶血素在重組大腸桿菌中能夠大量誘導(dǎo)表達(dá)，分子量約為42kba。利用Ni瓊脂糖親和層析柱對(duì)重組的坎氏弧菌TLH溶血素進(jìn)行純化，純化的TLH溶血素在SDS-PAGE電泳圖上為單一蛋白帶；利用Bradford法繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋坎氏弧菌ILH溶血素基因的克隆表達(dá)、蛋白純化及活性研究白曲線，得到純化的丁LH溶血素的濃度為0．41mg／mL。溶血素活性實(shí)驗(yàn)表明，純化的TLH溶血素具有較強(qiáng)的溶血活性(溶血圈直徑為16mm)及磷脂酶活性(渾濁內(nèi)圈直徑為llmm，透明外圈直徑為15r

7、am)。TLH溶血素溶血活力的最適溫度為37。C；溫度穩(wěn)定性檢測(cè)顯示，在小于37。C時(shí)較穩(wěn)定，45。C下孵育30rain其活力損失50％，55。C下孵育30min其活力損失75％，75。C下孵育30min即完全喪失溶血活力，證明坎氏弧菌TLH溶血素是熱不穩(wěn)定性溶血素。TLH溶血素的最適pH為6，在pH為5和7時(shí)，只有50％的活力，且TLH溶血素在pH5一10較穩(wěn)定，pH大于10或小于5時(shí)都會(huì)導(dǎo)致其穩(wěn)定性迅速下降。本實(shí)驗(yàn)中10種金屬離子洲a+，K+，M92+，Ca2+，Mn2+，C02+，Ni2+，Cu：+，Zn2+和Ba2+)對(duì)坎氏弧菌TLH溶血素溶

8、血活力的影響結(jié)果顯示，一價(jià)金屬離子如Na+、K+對(duì)溶血活性幾乎沒(méi)有影響，而部分二價(jià)金屬離子如Ca2+、C02