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1、溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)vscB基因的功能研究及vscD基因的克隆表達摘要溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)作為海洋水生經(jīng)濟動物的主要病原之一，給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重危害。因此，需對溶藻弧菌病菌進行有效的防控。Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TypeIIIsecretionsystem,T3SS）作為溶藻弧菌的毒力因子與其致病性關(guān)系密切，VscB蛋白和VscD蛋白是Ⅲ型分泌系統(tǒng)重要組成部分，可能在溶藻弧菌侵染宿主的過程發(fā)揮重要作用。本實驗以溶藻弧菌T3SS的vscB和vscD基因作為研究對象，分別克隆了vscB和vscD基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，vs
2、cB基因長為429bp，編碼142個氨基酸，理論分子量為16.4kDa，pI值為5.48；vscD基因長1302bp，編碼了433個氨基酸，分子量為47.9kDa，理論pI值為4.98。通過氨基酸序列同源性比對結(jié)果顯示，溶藻弧菌的VscB與副溶血弧菌的蛋白相似度最高，達到91％，而溶藻弧菌的VscD與魔鬼弧菌（Vibriodiabolicus）的蛋白相似度最高，達到97％。同時分別構(gòu)建了pET-28a-vscB和pET-32a-vscD原核表達載體，分別對其表達產(chǎn)物進行了可溶性檢測，結(jié)果顯示，VscB蛋白主要以包涵體的形式存在，而Vsc
3、D主要存在于上清中。分別對VscB蛋白和VscD蛋白進行western-blot分析，證實兩蛋白均在大腸桿菌中成功表達。利用OverlapPCR以及同源重組技術(shù)，結(jié)合氯霉素（Cm）正向篩選和vmt基因?qū)-阿拉伯糖敏感性，構(gòu)建了目的基因vscB無標(biāo)記基因框內(nèi)缺失株，同時構(gòu)建了其回補株。并分別對缺失株、回補株和野生株的生物學(xué)表型進行了比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌在缺失vscB基因的情況下，其生長曲線、胞外酶活性及生物膜生成能力與野生株和回補株相比并沒有明顯變化；vscB缺失株的泳動能力相比野生株明顯減弱；通過LD50檢測，發(fā)現(xiàn)其毒力比野生
4、株降低了23.2倍，將缺失株△vscB進行回補后，其毒力基本恢復(fù)至原有水平。可見，vscB基因與溶藻弧菌的致病能力相關(guān)。以缺失株△vscB作為免疫原，通過腹腔注射對石斑魚進行了免疫，在免疫一個月后，再用溶藻弧菌野生株對石斑魚進行攻毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受免疫的石斑魚抗病能力明顯增強，相對免疫保護率達到77.6％。表明缺失株△vscB可作為防治溶藻弧菌病的減毒活疫苗，具有一定的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：溶藻弧菌，Ⅲ型分泌系統(tǒng)，vscB，基因敲除ICloningandexpressionofvscDgeneandstudyonthefunctionofvs
5、cBgeneintypeIIIsecretionsystemofVibrioalginolyticusAbstractVibrioalginolyticusisoneofthemajorpathogensofmarineaquaticanimalsandVibriosis,ithascausedseriousdamagetotheaquacultureindustryintheworld.Therefore,effectivecontrolofVibrioalginolyticusisofimportance.ThetypeIIIsec
6、retionsystemofVibrioalginolyticusiscloselyrelatedtoitspathogenicityasavirulencefactor.VscBproteinandVscDproteinareimportantcomponentsoftypeIIIsecretionsystem,anditisspeculatedthattheymayplayanimportantroleintheprocessofinvadingthehost.vscBandvscDgenesofV.alginolyticusT3S
7、SwerestudiedandvscBandvscDgeneswerecloned.TheresultsshowedthatthevscBgenehasalengthof429bpandencodes142aminoacidswithatheoreticalmolecularweightof16.4kDaandapIvalueof5.48.ThevscDgeneis1302bpinlengthandencodes433aminoacidswithamolecularweightof47.9kDaandatheoreticalpIvalu
8、eof4.98.TheaminoacidsequencehomologycomparisonresultsshowedthattheVscBofvibrioalginolyticushadthehighes
