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《文蛤MmPlg基因和MmCtl基因的克隆、表達(dá)及功能研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、文蛤是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，但近年來養(yǎng)殖業(yè)出現(xiàn)了許多嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的〃瓶頸〃問題，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。纖溶酶和組織蛋白酶L等在動物的生長發(fā)育中具有重要作用。研究和了解文蛤的生長發(fā)育過程和調(diào)控機(jī)理?對文蛤人工育苗和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分重要理論價值和現(xiàn)實(shí)意義。本文以文蛤?yàn)檠芯繉ο?，研究?nèi)容主要分為以下5個部分：第1部分：通過RACE技術(shù)從文蛤體內(nèi)克隆到文蛤纖溶酶原MmPIg基因和文蛤組織蛋白酶LMmCtl基因?井對它們的核酸序列和編碼的蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；結(jié)果如下：(1)文蛤MmPIg基因
2、序列全長921bp，包含1個819bp的幵放閱讀框，編碼的蛋白含272個氨基酸殘基，其中前16個為信號肽序列。MmPIg蛋白的理論分于量為28.7kD，等電點(diǎn)為6.42，包含由組氨酸(His77)、大冬氨酸(Asp126)和絲氨酸(Se「220)組成的典型絲氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)?序列比對分析發(fā)現(xiàn)MmPIg和單環(huán)刺蟠(Urechisunicinctus)和櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的纖溶酶相似度較高。(2)文蛤MmCtl基因序列全長1304bp，包含1個1005bp的幵放閱讀框?推導(dǎo)的蛋白含3
3、34個氨基酸殘基，其中前16個為信號肽序列。MmCtl蛋白的理論分于量為37.5kD?理論等電點(diǎn)為5.27.利用ConservedDomainSearCh工具分析MmCtl蛋白序列，結(jié)果表明該酶是PeptidaseC1A亞家族成員?含有木瓜蛋白酶特異的活性催化位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)。第2部分：以文蛤-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析了MmPIg基因和MmCtl基因在文蛤發(fā)育不同時期(擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲、殼頂幼蟲和稚貝)mRNA表達(dá)量的變化；利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析了MmPIg基因和
4、MmCtl基因在文蛤成貝不同組織(肌肉、外套膜、鯉、腸和肝胰腺)中的mRNA表達(dá)量變化。結(jié)果如下：(1)組織定量結(jié)果顯示結(jié)果顯示MmPIg在各個組織中都有表達(dá)-而腸的表達(dá)量則明顯高于其它四個組織，是鮑中表達(dá)量的大約2倍；發(fā)育定量結(jié)果顯示在擔(dān)輪幼蟲和D型幼蟲時期，MmPIg的表達(dá)量變化不明顯?到殼頂幼蟲時期?MmPIg的表達(dá)量大幅度上調(diào)?文蛤發(fā)育成稚貝后，MmPIg表達(dá)量稍有下調(diào)，但還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前兩個時期。經(jīng)分析推測MmPIg可能參與文蛤?qū)I養(yǎng)成分的消化；(2)組織定量結(jié)果顯示結(jié)果顯示MmCtl在各個組織
5、中都有表達(dá)?肝胰腺的表達(dá)量最高；發(fā)育定量結(jié)果顯示，隨著文蛤發(fā)育MmCtl表達(dá)量呈明顯上調(diào)趨勢?從擔(dān)輪幼蟲到D型幼蟲MmCtl表達(dá)量稍有上升，到殼頂幼蟲期表達(dá)量大約為擔(dān)輪幼蟲期的20倍，至稚貝期表達(dá)量達(dá)到最高經(jīng)分析推測MmCtl可能通過細(xì)胞凋亡等機(jī)制參與了文蛤幼蟲的發(fā)育過程。第3部分：構(gòu)建了文蛤MmPIg基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌DE3宿主菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)表達(dá)，井對表達(dá)的蛋白進(jìn)行了純化，用純化后的DsbA-MmPIg融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了抗血清。結(jié)果如下：獲得的融合蛋白DsbA-MmPlg的
6、分于量為52.7kD*包涵體表達(dá)，用純化后的融合蛋白制備抗血清，WesternBlot結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)制備的抗血清具有較好的特異性。第4部分：對文蛤MmCtl基因進(jìn)行了原核表達(dá)，純化了融合蛋白，井制備了融合蛋白DsbA-MmCtl的抗血清。結(jié)果如下：獲得的融合蛋白DsbA-MmCtl的分于量為60.5kD，包涵體表達(dá)?用純化的融合蛋白進(jìn)行抗血清的制備?WesternBlot結(jié)果顯示該血清具有較好的特異性。尖鍵詞：文蛤；纖溶酶原；組織蛋白酶L;實(shí)時熒光定量PCR;原核表達(dá)；抗體制備；WesternBlotA
7、bstractMeretrixmeretrixisanimportantaquaCulturespeCiesinourCountry.ButreCentyears,alotof"bottleneck"problemswhiChseverelyrestrictedthedevelopmentoftheaquaCultureappearedandCausedgreateConomiClosses?FibrinolyticenzymeandCathepsinLplayimportantrolesingrowt
8、handdevelopmentofanimals?UnderstandingthegrowthprocessandregulationmeChanismofClamaremeanfulforartificialbreedingandthedevelopmentofaquaCultureintheoryandreality.Inthispaper,weusedMeretrixmeretrixastheresearchobject,theCon
