克隆基因表達(dá)及基因干擾-修

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1、克隆基因的表達(dá)及基因干擾北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科吳潔1克隆基因的表達(dá)及基因干擾第一節(jié)外源基因的表達(dá)第二節(jié)表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定第三節(jié)基因表達(dá)干擾技術(shù)2克隆基因的表達(dá)及基因干擾第一節(jié)外源基因的表達(dá)第二節(jié)表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定第三節(jié)基因表達(dá)干擾技術(shù)3第一節(jié)外源基因的表達(dá)遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程——中心法則（centraldogma）。基因表達(dá)4外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。第一節(jié)外源基因的表達(dá)克隆基因表達(dá)5第一節(jié)外源基因的表達(dá)一、原核生物表

2、達(dá)體系二、真核生物表達(dá)體系酵母，哺乳動物細(xì)胞大腸桿菌6一、原核生物表達(dá)體系（二）原核表達(dá)載體具有的特點（四）包涵體（一）對外源目的基因的要求（三）真核生物基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)7（一）對外源目的基因的要求1、不應(yīng)具有5′端非編碼區(qū)以及內(nèi)含子結(jié)構(gòu)2、不能直接用真核基因組DNA.3、常以cDNA為模板，設(shè)計引物，PCR擴增目的基因.一、原核生物表達(dá)體系8選擇標(biāo)志啟動子：乳糖啟動子lac，色氨酸啟動子trp等翻譯調(diào)控序列，如核糖體結(jié)合位點(SD序列)，及翻譯起始點和終止序列多克隆位點(MCS)（二）原核表達(dá)載體具有的特點一、原核生物表達(dá)體系原核啟

3、動子SD序列MCS終止子9原核啟動子大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致序列：-35box和-10box（Pribnowbox）TTGACA10consensussequences11核糖體結(jié)合位點（ribosomebindingsite,RBS）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。SDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——16SrRNA3’UCCUCCAS-D序列距離AUG的距離也影響翻譯12（三）真核生物基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1.非融合型表達(dá)蛋白2.融合型表達(dá)蛋白3.分泌型表

4、達(dá)蛋白一、原核生物表達(dá)體系131.非融合型表達(dá)蛋白載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。優(yōu)點：表達(dá)的非融合蛋白與天然狀態(tài)下存在的蛋白在結(jié)構(gòu)、功能以及免疫原等方面基本一致缺點：易被細(xì)菌蛋白酶破壞（三）真核生物基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)一、原核生物表達(dá)體系SD序列ATG-外源基因-TAG14常用的非融合型表達(dá)蛋白原核表達(dá)載體pKK223-3抗氨芐青霉素基因tac啟動子(trp-lac)SD序列AUG起始密碼轉(zhuǎn)錄終止序列T1和T2一、原核生物表達(dá)體系152.融合型表達(dá)蛋白表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的

5、。優(yōu)點：具有抗原性可作為抗原，可以抵御細(xì)菌蛋白酶的破壞。便于融合蛋白的分離和純化。一、原核生物表達(dá)體系16融合型表達(dá)系統(tǒng)主要有GST系統(tǒng)His系統(tǒng)金黃色葡萄球菌蛋白A系統(tǒng)β-半乳糖苷酶系統(tǒng)麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)一、原核生物表達(dá)體系17①啟動子：tac②操縱基因：lacP③調(diào)節(jié)基因：lacI④S-D序列⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）GST系統(tǒng)----pGEX系列1、載體組成結(jié)構(gòu):lacItaclacOS-D/ATGGST插入位點TGAlacP18GST融合蛋白用GlutathioneSepharose親和層析柱

6、分離純化。GST系統(tǒng)----pGEX系列2、產(chǎn)物提純:3、產(chǎn)物分離:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。柱（column）GST外源蛋白凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脫柱（column）可再利用＋19His-tag（組氨酸標(biāo)簽）：在外源多肽的N端或C端接上6個組氨酸（6×His）His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被咪唑（或EDTA溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。His系統(tǒng)20213.分泌型表達(dá)蛋白載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞外。一、原核生物表達(dá)體系pINIII系

7、列載體pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位點22（四）包涵體(inclusionbody)一、原核生物表達(dá)體系大腸桿菌高效表達(dá)外源基因時形成的膜包裹的高密度、不溶性和無活性的蛋白質(zhì)顆粒。23（四）包涵體(inclusionbody)1.包涵體的形成2.包涵體的分離與純化3.包涵體的復(fù)性一、原核生物表達(dá)體系241.包涵體的形成表達(dá)產(chǎn)率過高，超出細(xì)菌蛋白水解能力，產(chǎn)物積聚，與目的蛋白中含硫氨基酸含量呈正相關(guān)。原核表達(dá)體系缺乏翻譯后修飾酶類和輔助因子，中間

8、產(chǎn)物易大量積聚。發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點25有利于目標(biāo)蛋白的富集，使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必