第七章 克隆基因的表達(dá)及基因干擾.ppt

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1、第七章克隆基因的表達(dá)及基因干擾上海交通大學(xué)倪培華第七章克隆基因的表達(dá)及基因干擾第一節(jié)外源基因的表達(dá)第二節(jié)表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定第三節(jié)基因表達(dá)干擾技術(shù)第一節(jié)外源基因的表達(dá)第一節(jié)外源基因的表達(dá)二、真核生物表達(dá)體系一、原核生物表達(dá)體系一、原核生物表達(dá)體系（二）原核表達(dá)載體具有的特點(diǎn)（四）包涵體（一）對(duì)外源目的基因的要求（三）真核生物基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)一、原核生物表達(dá)體系（一）對(duì)外源目的基因的要求不應(yīng)具有5′端非編碼區(qū)以及內(nèi)含子結(jié)構(gòu)選擇標(biāo)志啟動(dòng)子翻譯起始點(diǎn)和終止序列多克隆位點(diǎn)（二）原核表達(dá)載體具有

2、的特點(diǎn)一、原核生物表達(dá)體系一、原核生物表達(dá)體系（三）真核生物基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)1.非融合型表達(dá)蛋白2.融合型表達(dá)蛋白3.分泌型表達(dá)蛋白1.非融合型表達(dá)蛋白優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)的非融合蛋白與天然狀態(tài)下存在的蛋白在結(jié)構(gòu)、功能以及免疫原性等方面基本一致缺點(diǎn)：易被細(xì)菌蛋白酶破壞（三）真核生物基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)一、原核生物表達(dá)體系常用的非融合型表達(dá)蛋白表達(dá)原核載體pKK223-3抗氨芐青霉素基因Tac啟動(dòng)子SD序列AUG起始密碼轉(zhuǎn)錄終止序列T1和T2一、原核生物表達(dá)體系一、原核生物表達(dá)體系2.融合型表達(dá)蛋白優(yōu)

3、點(diǎn)：融合蛋白具有抗原性可以作為抗原，可以抵御細(xì)菌蛋白酶的破壞一、原核生物表達(dá)體系融合型表達(dá)系統(tǒng)主要有His系統(tǒng)GST系統(tǒng)金黃色葡萄球菌蛋白A系統(tǒng)β-半乳糖苷酶系統(tǒng)麥芽糖結(jié)合蛋白系統(tǒng)一、原核生物表達(dá)體系3.分泌型表達(dá)蛋白可防止大腸桿菌對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的降解，而且能夠減輕大腸桿菌代謝負(fù)荷和易于恢復(fù)表達(dá)產(chǎn)物天然構(gòu)象（四）包涵體1.包涵體的形成2.包涵體的分離與純化3.包涵體的復(fù)性一、原核生物表達(dá)體系二、真核生物表達(dá)體系（一）酵母表達(dá)體系（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系二、真核生物表達(dá)體系（一）酵母表達(dá)體系1.酵母表

4、達(dá)載體2.酵母表達(dá)外源性基因的形式二、真核生物表達(dá)體系（一）酵母表達(dá)體系1、酵母表達(dá)載體選擇性標(biāo)志復(fù)制子啟動(dòng)子上游活性序列終止序列蛋白結(jié)構(gòu)域二、真核生物表達(dá)體系2.酵母表達(dá)外源性基因的形式非分泌型分泌型二、真核生物表達(dá)體系（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系1.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體2.常用的外源基因轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方式3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系1.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體(1)原核DNA序列(2)啟動(dòng)子(3)增強(qiáng)子(4)剪接信號(hào)(5)遺傳標(biāo)記(6)終止信號(hào)和多聚腺苷化的

5、信號(hào)二、真核生物表達(dá)體系二、真核生物表達(dá)體系細(xì)胞系DNA轉(zhuǎn)染方式最初的應(yīng)用CV-1SV40病毒感染表達(dá)野生型、突變蛋白CV-1/293腺病毒感染表達(dá)野生型、突變蛋白COS瞬時(shí)DEAE-葡聚糖在哺乳類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)，快速鑒定cDNA克隆，表達(dá)突變蛋白。NIH3T3逆轉(zhuǎn)錄病毒感染轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、在不同類(lèi)型細(xì)胞中表達(dá)鼠成纖維細(xì)胞MOP瞬時(shí)DEAE-葡聚糖快速鑒定cDNA克隆表達(dá)突變蛋白CHO-DHFR穩(wěn)定DHFR+轉(zhuǎn)染用氨甲喋呤擴(kuò)增高效穩(wěn)定表達(dá)靈長(zhǎng)/嚙齒類(lèi)痘病毒疫苗神經(jīng)元細(xì)胞EB病毒載體HSV病毒載體克隆表達(dá)基

6、因轉(zhuǎn)移2.常用的外源基因轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方式3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)（1）COS細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)（2）CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)二、真核生物表達(dá)體系第二節(jié)表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定第二節(jié)表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化與鑒定二、酵母重組表達(dá)蛋白的分離與純化三、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定一、大腸桿菌重組表達(dá)蛋白的分離與純化一、大腸桿菌重組表達(dá)蛋白的分離與純化1.粗制品的分離純化2.精制品的分離純化二、酵母重組表達(dá)蛋白的分離與純化1.酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的分離純化2.酵母表達(dá)分泌型重組蛋白的分離與純化三、

7、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定1.蛋白質(zhì)樣品的制備2.SDS聚丙烯耽胺凝膠電泳3.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移四、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定4.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)封閉靶蛋白與第一抗體反應(yīng)與第二抗體反應(yīng)顯色四、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定四、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定第三節(jié)基因表達(dá)干擾技術(shù)第三節(jié)基因表達(dá)干擾技術(shù)二、核酶與脫氧核酶三、小干擾RNA四、微RNA一、反義核酸技術(shù)一、反義核酸技術(shù)（二）反義RNA技術(shù)（三）反義核酸技術(shù)的應(yīng)用（一）反義寡核苷酸技術(shù)一、反義核酸技術(shù)（一）反義寡核苷酸技術(shù)1.反義寡核苷酸的作用機(jī)制2.反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成3.反義寡核苷酸的修飾4

8、.反義寡核苷酸的給藥途徑一、反義核酸技術(shù)（一）反義寡核苷酸技術(shù)1.反義寡核苷酸的作用機(jī)制(1)抑制mRNA的翻譯(2)抑制復(fù)制或轉(zhuǎn)錄(3)抑制蛋白質(zhì)的加工、修飾及功能表達(dá)一、反義核酸技術(shù)2、反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成1）設(shè)計(jì)①計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)②利用寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)鑒別mRNA上的RNaseH切割位點(diǎn)、寡核苷酸芯片的掃描分析、隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄分析法等對(duì)自然折疊的mRNA進(jìn)行設(shè)計(jì)一、反義核酸技術(shù)2）合成①長(zhǎng)度一般為15～25個(gè)核苷酸②G-C含量為60%～65%一、反