資源描述：
《大鼠nogo基因片段的克隆及與gst融合蛋白的表達和純化論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、大鼠Nogo基因片段的克隆及與GST融合蛋白的表達和純化論文張萍程希平費玲玲王春婷楊浩陳鑌復鞠躬【關鍵詞】Nogo基因CloningofadultratNogogenesegmentsandexpressionandpurificationoftheircodingproteinfusedents,expressefficientlyinE.coliandpurifythetargetproteins.METHODS:NogogenesegmentsplifiedbyRTPCRfromnormaladultSDratspinalcor
2、dtotalRNA.Aftersequenced,thereconstructedexpressionvectorsedigestionandsubclonedintoexpressionvectorpGEX4T1.ThenthevectorsedintoE.coliDH5α.RebinantGSTfusionproteinsn.RESULTS:ThesequencesofclonedadultratNogogenesegments(570-691and1028-1089amineacidresidues)entshavebeensu
3、ccessfullyclonedandefficientlyexpressedinE.coli,andtheGSTfusedtargetproteinshavebeenpurifiedtohighpurity.【Keyacia公司；pGEMTeasy載體、RTPCR試劑盒及Tvector試劑盒、各種限制性內切酶、連接酶及TaqDNA聚合酶均為美國Promega公司產品；DNA酶和高純質粒提取試劑盒為德國BoehringerMannheim公司產品；IPTG,DTT,DTE,胱胺、谷胱甘肽瓊脂糖及還原性谷胱甘肽，均為Sigma公司產品；
4、其余一般化學試劑均為國產分析純.成年SD大鼠由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供.1.2方法1.2.1Nogo片段的擴增取成年SD大鼠的脊髓，按照Trizol操作指南提取總RNA，并以此為模板進行RTPCR，擴增Nogo氮端623~640氨基酸殘基及胞外段的1024~1089氨基酸殘基的cDNA片段，分別命名為NogoN和Nogo66.NogoN的引物序列如下：5′端引物：5′GGAATTCACAGCACAGCTTTGCCCAT3′，3′端引物：5′GCGTCGACTTAATCTGGACTTGGCTCAGTGGA3′；Nogo66的引物序列
5、如下：5′端引物：5′GGAATTCTATAAGGGCGTGATCCAGG3′，3′端引物：5′AACTGAGGCGGCTTTTCTTATAAGTCGACGC3′.48℃45min反轉錄，94℃變性，55℃復性1min5個循環(huán)，60℃復性1min30個循環(huán).1.2.2RTPCR產物的克隆與鑒定回收RTPCR產物，與質粒pGEMTEasy進行連接反應，轉化感受態(tài)DH5α.挑取白色菌落進行酶切鑒定，所獲陽性克隆命名為pGEMNogoN和pGEMNogo66，送至上海申友公司進行測序.經EcoRⅠ，SalⅠ雙酶切后與經同樣酶切的pGEX4T
6、1進行連接反應，挑選的陽性克隆子命名為pGEXNogoN和pGEXNogo66.1.2.3目的蛋白的誘導表達和純化工程菌在含氨芐青霉素（100mgL-1）的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按10%的接種量進行轉接，250rmin-1,37℃搖菌至A600=1，加入異丙基βD硫代半乳糖苷至終濃度為0.5mmolL-1，37℃繼續(xù)通氣培養(yǎng)4~5h.取1.5mL菌液，7734g離心30s收集菌體，菌體加入H2O60μL，劇烈振蕩混勻，再加入4×樣品緩沖液20μL，100℃，5min；7734g離心5min；100gL-1SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，
7、預計相對分子質量（Mr）32和39×103處有明顯的蛋白表達.大規(guī)模培養(yǎng)細菌，誘導表達目的蛋白，收集菌體，超聲破菌.離心后將上清和沉淀分別制樣，進行SDSPAGE.可溶的目的蛋白直接應用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱進行親和層析純化.以包涵體形式存在的表達產物.用N十二烷基肌氨酸鈉將沉淀蛋白質變性過夜，經緩慢透析去除N十二烷基肌氨酸鈉，令蛋白復性后，用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱對目的蛋白進行親和層析純化.2結果2.1Nogo片段的擴增及序列測定RTPCR擴增Nogo66和NogoN的部分cDNA，分別得到182bp和384bp的片段（Fig1
8、）.挑取含插入片段的陽性克隆pGEMNogoN和pGEMNogo66，用高純質粒提取試劑圖1NogoN和Nogo66RTPCR擴增結果(略)盒提取質粒，測序結果表明所擴增的NogoN和Nogo66與GeneBank公布的
