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《大鼠nogo基因片段的克隆及與gst融合蛋白的表達(dá)和純化 》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、大鼠Nogo基因片段的克隆及與GST融合蛋白的表達(dá)和純化張萍程希平費(fèi)玲玲王春婷楊浩陳鑌復(fù)鞠躬【關(guān)鍵詞】Nogo基因 CloningofadultratNogogenesegmentsandexpressionandpurificationoftheircodingproteinfusedents,expressefficientlyinE.coliandpurifythetargetproteins.METHODS:NogogenesegmentsplifiedbyRTPCRfromnormaladultSDratspinalcordtotalRNA.Aftersequenced,there
2、constructedexpressionvectorsedigestionandsubclonedintoexpressionvectorpGEX4T1.ThenthevectorsedintoE.coliDH5α.RebinantGSTfusionproteinsn.RESULTS:ThesequencesofclonedadultratNogogenesegments(570-691and1028-1089amineacidresidues)entshavebeensuccessfullyclonedandefficientlyexpressedinE.coli,andtheGSTfus
3、edtargetproteinshavebeenpurifiedtohighpurity. 【Keyacia公司；pGEMTeasy載體、RTPCR試劑盒及Tvector試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶、連接酶及TaqDNA聚合酶均為美國Promega公司產(chǎn)品；DNA酶和高純質(zhì)粒提取試劑盒為德國BoehringerMannheim公司產(chǎn)品；IPTG,DTT,DTE,胱胺、谷胱甘肽瓊脂糖及還原性谷胱甘肽，均為Sigma公司產(chǎn)品；其余一般化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純.成年SD大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供. 1.2方法 1.2.1Nogo片段的擴(kuò)增取成年SD大鼠的脊髓，按照Trizol操作指南提取總R
4、NA，并以此為模板進(jìn)行RTPCR，擴(kuò)增Nogo氮端623~640氨基酸殘基及胞外段的1024~1089氨基酸殘基的cDNA片段，分別命名為NogoN和Nogo66.NogoN的引物序列如下：5＇端引物：5＇GGAATTCACAGCACAGCTTTGCCCAT3＇，3＇端引物：5＇GCGTCGACTTAATCTGGACTTGGCTCAGTGGA3＇；Nogo66的引物序列如下：5＇端引物：5＇GGAATTCTATAAGGGCGTGATCCAGG3＇，3＇端引物：5＇AACTGAGGCGGCTTTTCTTATAAGTCGACGC3＇.48℃45min反轉(zhuǎn)錄，94℃變性，55℃復(fù)性1min5個循環(huán)，
5、60℃復(fù)性1min30個循環(huán). 1.2.2RTPCR產(chǎn)物的克隆與鑒定回收RTPCR產(chǎn)物，與質(zhì)粒pGEMTEasy進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α.挑取白色菌落進(jìn)行酶切鑒定，所獲陽性克隆命名為pGEMNogoN和pGEMNogo66，送至上海申友公司進(jìn)行測序.經(jīng)EcoRⅠ，SalⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的pGEX4T1進(jìn)行連接反應(yīng)，挑選的陽性克隆子命名為pGEXNogoN和pGEXNogo66. 1.2.3目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化工程菌在含氨芐青霉素（100mg?L-1）的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按10%的接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接，250r?min-1,37℃搖菌至A600=1，加入異丙基βD硫代半乳糖苷
6、至終濃度為0.5mmol?L-1，37℃繼續(xù)通氣培養(yǎng)4~5h.取1.5mL菌液，7734g離心30s收集菌體，菌體加入H2O60μL，劇烈振蕩混勻，再加入4×樣品緩沖液20μL，100℃，5min；7734g離心5min；100g?L-1SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，預(yù)計相對分子質(zhì)量（Mr）32和39×103處有明顯的蛋白表達(dá).大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，收集菌體，超聲破菌.離心后將上清和沉淀分別制樣，進(jìn)行SDSPAGE.可溶的目的蛋白直接應(yīng)用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱進(jìn)行親和層析純化.以包涵體形式存在的表達(dá)產(chǎn)物.用N十二烷基肌氨酸鈉將沉淀蛋白質(zhì)變性過夜，經(jīng)緩慢透析去除N十二烷基肌氨酸鈉，
7、令蛋白復(fù)性后，用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析柱對目的蛋白進(jìn)行親和層析純化. 2結(jié)果 2.1Nogo片段的擴(kuò)增及序列測定RTPCR擴(kuò)增Nogo66和NogoN的部分cDNA，分別得到182bp和384bp的片段（Fig1）.挑取含插入片段的陽性克隆pGEMNogoN和pGEMNogo66，用高純質(zhì)粒提取試劑 圖1NogoN和Nogo66RTPCR擴(kuò)增結(jié)果 (略) 盒提取質(zhì)粒，測序結(jié)果表明所擴(kuò)增的N
