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《gst_talin1融合蛋白的原核表達及純化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第25卷第3期生物學雜志Vol125No132008年6月JOURNALOFBIOLOGYJun,2008GST2talin1融合蛋白的原核表達及純化1,22吳爽,耿建國(1廣東藥學院基礎學院組織胚胎教研室,廣州510006;2中科院生化細胞研究所分子細胞生物學實驗室,上海200031)摘要:應用PCR方法擴增talin1的cDNA,并將其重組入谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶融合基因表達載體pGEX24T21中,獲取人源的GST2talin1融合蛋白,為下階段深入的研究talin1的結構、功能、及其與之相互作用的蛋白打下基礎。經(jīng)酶切、序列鑒定,選擇
2、正確重組子,將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導表達,用GlutathioneSepharose4B柱純化,westernblot鑒定。克隆得到了一個2400bp的talin1的cDNA片斷,重組質(zhì)粒目的DNA測序正確,純化出分子量約為12116kD的融合蛋白。用基因工程方法使GST2talin1重組質(zhì)粒在原核細胞表達并成功純化出GST2talin1融合蛋白。關鍵詞:talin;P2選凝素;GST2融合蛋白;親和層析中圖分類號:Q51文獻標識碼:A文章編號:1008-9632(2008)03-0033-03P-選凝素
3、(P-selectin)是一種由細胞產(chǎn)生的粘物公司產(chǎn)品。附分子(adhesionmolecules),存在于細胞表面,能夠介1.2方法導細胞與細胞間或細胞與基質(zhì)間相互接觸和結合。其1.2.1目的基因的擴增及純化根據(jù)已公布的人源在炎癥反應、凝血機制、甚至在某些腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)talin1的cDNA序列設計talin1的引物,上游引物T1的[1]揮重要作用。一直以來P2selectin受到許多研究者序列為5′23′atcagtaggaattcatgcgggacctagaccagg;的青睞。P2selectin分子的特性到目前為止,人們已
4、有下游引物T2的序列為5′23′gaagtcatctcgaggtgctcatc較豐富的研究。本實驗室以P2selectin的cytoplasmictcgaagctctg,在上下游引物中分別加入EcoRI和XhoIdomain為餌從人白細胞cDNA文庫中篩選到幾個基酶切位點。PCR反應總體積為50μL,包括ddH2O因,經(jīng)測序可知其中之一為talin1(從第1672個氨基酸4015μL、10×buffer5μL、4dNTP1μL、上下游引物各殘基到蛋白末端)。因此本試驗利用重組DNA技術,1μL、模板1μL、LaTaq酶015μL。反
5、應條件為:94℃獲得talin1的cDNA,構建了GST2talin1融合蛋白表達2min,94℃50s、56℃50s,72℃2min,72℃5min,共35載體,在大腸桿菌中表達并純化該融合蛋白,為進一研個循環(huán)。所獲得的PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳究talin1與P2selectin是否存在相互作用及相互作用機進行鑒定。將目的條帶切下,用DNA片斷快速純化回制,奠定了基礎。收試劑盒回收。1材料和方法1.2.2pGEX24T212talin1重組質(zhì)粒的構建將純化的1.1材料PCR產(chǎn)物和pGEX24T21載體用EcoRI和XhoI
6、雙酶切1.1.1菌株、質(zhì)粒人源talin1的cDNA及融合表達后,分別回收酶切產(chǎn)物。取回收后的talin1片斷載體pGEX24T21為實驗室保存。DH5α及BL21大腸815μL,載體片斷015μL,10×T4DNA連接酶buffer桿菌感受態(tài)購自上海申能博采生物公司。1μL,T4DNA連接酶013μL,16℃連接過夜。1.1.2生化試劑和分子生物學試劑引物由上海生1.2.3重組質(zhì)粒的篩選和鑒定將連接產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)工生物有限公司合成,限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶化入DH5α感受態(tài)細菌,在含有氨芐青霉素(Amp)的購自Promega公司
7、,1kbDNAMarker、DNA片斷快速純LB上37℃篩選培養(yǎng)過夜。次日挑取單個菌落,培養(yǎng)化及回收試劑盒購自北京鼎國生物技術公司,PCR試12h后小量抽取質(zhì)粒,用EcoRI和XhoI雙酶切,篩選陽劑購自日本TAKARA公司,氨芐青霉素為上海華舜生性重組質(zhì)粒并送上海英駿生物技術有限公司測序。收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11作者簡介:吳爽(1979-),女,碩士,助教,教學和研究方向,細胞生物學,E2mail:wushuang21977@163.com;通迅作者:耿建國(1955-),男,博士,研究員,研
8、究方向,細胞粘連與遷移。33第25卷第3期生物學雜志Vol125No132008年6月JOURNALOFBIOLOGYJun,20081.2.4融合蛋白的誘導表達將測序正確的重組質(zhì)融合蛋白和GST蛋白。按常規(guī)方法進行westernbl
