β分泌酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及融合蛋白純化

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1、β分泌酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及融合蛋白純化：朱愛(ài)華李敬陸軍錢(qián)進(jìn)鄭元林【摘要】目的構(gòu)建小鼠β分泌酶原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)其表達(dá)和純化，為進(jìn)一步研究β分泌酶的作用奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)基因文庫(kù)中小鼠β分泌酶基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，采用RTPCR方法擴(kuò)增到β分泌酶的cDNA片段，克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET28a中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，測(cè)序鑒定后，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，經(jīng)親合層析純化。結(jié)果從小鼠的腦組織RNA中擴(kuò)增出特異的β分泌酶基因片段長(zhǎng)1506bp，經(jīng)酶切鑒定及DNA序列測(cè)定，證實(shí)重組載體pET

2、28aBACE構(gòu)建正確，表達(dá)融合蛋白分子量約為55kD，經(jīng)鎳離子親合柱層析純化獲得電泳級(jí)純度的目的蛋白。結(jié)論在大腸桿菌中獲得了小鼠β分泌酶的高效表達(dá)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】β分泌酶；大腸桿菌；表達(dá)；融合蛋白【Abstract】ObjectiveTobuildmiceβsecretaseprokaryoticexpressionvectorandinduceitsexpressionandpurification,toaffordbasisforβsecretaseresearch.Me

3、thodsPrimericeβsecretasegenecDNAinGenbank.cDNAsegmentofβsecretasegeneplifiedbyRTPCR,thenclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET28aandtransformedintoE.coliBL21(DE3).Aftersequencedandidentified,fusionproteinentamplifiedfromRNAofmicebraintissueolecularHⅠ、T4DNA連

4、接酶等工具酶(購(gòu)自大連寶生物工程公司)；Trizol試劑及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司)；PfuDNA聚合酶及溶菌酶(上海生工生物工程公司)；PCR純化和膠回收試劑盒(購(gòu)自上海華舜生物工程公司)；DNAmarker、中分子量蛋白質(zhì)marker是Fermentas公司產(chǎn)品；鎳離子親合層析柱(Novagen公司產(chǎn)品)；其他化學(xué)試劑均為分析純?！　?.2寡核苷引物的設(shè)計(jì)與合成　　根據(jù)基因文庫(kù)中小鼠BACE基因的cDNA序列及相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成2條引物P1:5′TAGGATCCATGGCCCCAG

5、CGCTGCACT3′(劃線(xiàn)部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；P2:5′CGGAATTCTTACTTGAGCAGGGAGATGTCA3′(劃線(xiàn)部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。由上海生工生物工程公司合成?！　?.3RTPCR　　迅速分離小鼠的大腦皮層組織，Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以P1和P2做為上、下游引物，設(shè)置PCR參數(shù)：為94℃5min；94℃30s,55℃45s,72℃90s,循環(huán)30次,72℃10min,擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析,觀(guān)察片段大小，并純化PCR產(chǎn)物?！　?.4重

6、組表達(dá)載體的構(gòu)建　　將純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后克隆進(jìn)入經(jīng)同樣雙酶切的pET28a質(zhì)粒中，獲得pET28aBACE重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化DE3感受態(tài)細(xì)胞，篩選、鑒定陽(yáng)性克隆?！　?.5融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)　　挑取含有質(zhì)粒pET28aBACE的DE3一單菌落，接種于50ml含有50μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1%的接種量接種到新鮮的含50μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。通過(guò)不同的誘導(dǎo)時(shí)間和異丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)濃度優(yōu)化其表達(dá)條

7、件，12%SDSPAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。在擴(kuò)大培養(yǎng)至A6000.4～0.6時(shí)加IPTG使終濃度1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)5h后收集菌體。　　1.6融合蛋白的親合純化　　離心收集誘導(dǎo)后的菌體，溶菌酶裂解后，離心，上清和沉淀分別取樣，12%SDSPAGE檢測(cè)，確定目的蛋白所在部位。鎳凝膠親和層析法純化目的蛋白，純化后可得到經(jīng)SDSPAGE電泳檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色單一條帶的蛋白?！　?.3重組蛋白的表達(dá)　　含重組質(zhì)粒pET28aBACE的DE3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后1h出現(xiàn)新的蛋白質(zhì)，就有融合蛋白的表達(dá)(圖3)。隨著培

8、養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，融合蛋白的表達(dá)量隨之增加。但到4h后融合蛋白的表達(dá)達(dá)到高峰并處于穩(wěn)定水平，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加沒(méi)有明顯變化。因此，在大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)候，誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)5h左右就可收獲菌體。通過(guò)SDSPAGE電泳結(jié)果還證實(shí)，誘導(dǎo)劑加入4h后，融合蛋白的表達(dá)約占細(xì)菌總蛋白的30%左右。表明這一新的融合表達(dá)載體能以較高水平表達(dá)融合蛋白?！　?.4目的