hbvhev融合二價(jià)抗原原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白初步表達(dá)

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1、HBV/HEV融合二價(jià)抗原原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的初步表達(dá)要】?　　目的:構(gòu)建一個(gè)能夠表達(dá)出乙/戊型肝炎二價(jià)抗原的重組原核表達(dá)載體,并在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)。方法:采用PCR方法擴(kuò)增出HBV的S基因和HEV的ORF2編碼區(qū)的羧基末端中的414～606aa的基因片段,將兩片段連接后克隆入T載體,得到融合基因,將融合基因克隆入含有Ω增強(qiáng)子的pTΩTE高效的原核表達(dá)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pTΩT7SE。將pTΩT7SE轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用Westernblot鑒定融合蛋白。結(jié)果:獲得全長為1284bp的融合的HBV/HEV

2、的基因片段。已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTΩT7SE轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),表達(dá)出相對分子質(zhì)量（Mr）約為50000重組蛋白。SDSPAGE分析顯示,表達(dá)的蛋白主要以不溶性包涵體的形式存在于胞質(zhì)中,表達(dá)量約占全菌蛋白的30.52%。Westernblot結(jié)果表明在Mr為50000處可見特異性著色帶。結(jié)論:成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pTΩT7SE,并表達(dá)出目的蛋白,為研制預(yù)防乙型和戊型肝炎雙價(jià)疫苗提供了實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】?HBVHEV重組原核表達(dá)載體二價(jià)疫苗　　乙型肝炎（HBV）是危害全球人類健康最重要的傳染病之一,?它除能夠誘發(fā)急性或慢性肝炎外

3、,?還與人的肝硬化和肝癌等死亡率極高的疾病有直接的關(guān)系[1,2]。世界衛(wèi)生組織估計(jì)2000年全球慢性HBV攜帶者達(dá)4億人[3,4],?其中有可能發(fā)展為肝細(xì)胞癌。而戊型肝炎（HEV）病毒是戊型病毒性肝炎的病原體,?主要經(jīng)消化道傳播,?常通過飲用被HEV污染的水源而引起爆發(fā)性流行,?主要累及一些發(fā)展中國家,?散發(fā)性病例呈全球性分布。HEV對HBV的復(fù)制無影響,?但HEV感染會(huì)加重乙肝患者肝臟損害和臨床癥狀,?并可推測HEV對乙型肝炎發(fā)展有促進(jìn)作用[5]。???　　HBV的基因組位于衣殼內(nèi),?為3.2kb的不完全雙鏈的開環(huán)DNA,?基因組共有4個(gè)公認(rèn)的開放讀框,?分別為編碼包膜

4、蛋白HBsAg的s區(qū),?編碼衣殼的核心區(qū)(C區(qū),?HBcAg),?編碼病毒聚合酶的P區(qū),?以及編碼X抗原(HBxAg)的X區(qū)?？寺BSAg基因,?將其轉(zhuǎn)入酵母中表達(dá),?表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行加工處理即成為目前廣泛使用的基因工程疫苗[6]。而最早的戊型肝炎病毒重組研究是用大腸桿菌表達(dá)的。1992年P(guān)urdy等[7]將緬甸株HEVORF2的3′端大約三分之二基因片段插入pATH10,?在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白trpEC2。經(jīng)Wersternblot分析證明,?trpEC2具有很好的抗原性和廣泛性。但目前即可以抗乙肝又可以抗戊肝的疫苗尚沒有研究。為此本課題組展開此項(xiàng)研究,?將HBV

5、/HEV的融合基因SE,?克隆入融和表達(dá)載體pTΩTE中,?轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,?以期表達(dá)出融合蛋白。為進(jìn)一步研究其免疫保護(hù)效果及制備抗乙肝和戊肝的雙價(jià)DNA疫苗奠定了基礎(chǔ)?！　??材料和方法　　1.1?材料?T載體pTA2（從鼎國公司購買）;??pTΩTEE質(zhì)粒（由廈門大學(xué)提供）;??大腸桿菌DH5α及BL21（DE3）;??pADR1質(zhì)粒由由南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所朱進(jìn)博士惠贈(zèng)。乙肝和戊肝患者陽性血清及陰性對照血清來自于吉林省長春市肝膽病醫(yī)院,?辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG購自Sigma公司。TaKaRaExTaq酶,?T4DNA連接酶,?EcoRI酶,?X

6、hoI酶,?NdeI酶（從寶生物公司購買）;??胰蛋白胨,?酵母提取物,?IPTG,?甘油,?DTT,?Bis,?Acr,?Aps,?瓊脂糖,?瓊脂,?低Mr標(biāo)準(zhǔn)蛋白:?markerDL15000;??λDNA/EcoRI和HindIII;?TEMED,?硝酸纖維素膜,?Tris等（從鼎國公司購買）;??蛋白轉(zhuǎn)印PVDF膜（購自Millipore公司）;??Westernblot化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（SuperSignalWestPicoTrailKit）（購自Pierce公司）;??Xray底片（購自Kodak公司）;??DYCZ24D雙垂直電泳槽（北京六一儀器廠）;

7、??VE186轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）。　　1.2?方法　　1.2.1?目的基因的獲取?PCR擴(kuò)增乙型肝炎adr亞型的S基因[8]。上游引物F1:?5′CGGAATTCATGGAGAACACAAC3′（GAATTC為EcoRI酶切位點(diǎn)）。下游引物F2:5′CGCTCGAGTCAAATGTATACC3′（CTCGAG為XhoI酶切位點(diǎn),?去除終止密碼子）。由于上下游引物之間存在引物二聚體,?所以在PCR反應(yīng)體系中,?先加上游引物,?設(shè)計(jì)程序?yàn)?5℃,?4min。95℃,?30s;??57℃,?45s;??7