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《鼠hmgb1蛋白的原核表達(dá)及分離純化》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、鼠HMGB1蛋白的原核表達(dá)及分離純化：趙中夫楊慧劉明社張蕓楊柳絮封江南【關(guān)鍵詞】高遷移率族蛋白1；原核表達(dá)載體；純化 摘要目的：克隆小鼠HMGB1基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并分離純化獲得His-HMGB1的融合蛋白。方法：脂多糖刺激后的RAGB1的目的片段，克隆于pMD-19T載體，再亞克隆至含有pelB引導(dǎo)肽及His-標(biāo)簽肽的高效表達(dá)載體pET-26b(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后行SDS-PAGE鑒定目標(biāo)蛋白表達(dá)，用鎳鰲合瓊脂糖凝膠親和層析法分離純化含His-標(biāo)簽肽的
2、目的蛋白。結(jié)果：經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小為648bp的HMGB1基因片段，成功構(gòu)建目標(biāo)蛋白的融合表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化，獲得了約30kD的融合蛋白。結(jié)論：構(gòu)建HMGB1的融合表達(dá)載體，獲得分離純化融合蛋白His-HMGB1，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)?！ ￡P(guān)鍵詞高遷移率族蛋白1；原核表達(dá)載體；純化 MouseHMGB1ProkaryoticExpressionandPurification AbstractObjective:ToclonemouseHighmobilitygroupbox1(HMGB1
3、)geneandconstructtheprokaryoticexpressionvector,toinduceandpurifytheexpressedfusionproteinHMGB1.Methods:ThetotalRNAmouseRAD-19T.ThebinantvectorplateforPCRingE.coliBL21(DE3)andfourhoursinductionbyIPTG,HMGB1expressionconfirmedbySDS-PAGEandthepurificationedbyNi2+-
4、chelateaffinitychromatograph.Results:ThetargetDNAsequenceofHMGB1idpET-26b(+)-HMGB1obilitygroupbox1;Prokaryoticexpressionvector;Purification 高遷移率族蛋白B1(Highmobilitygroupbox1，HMGB1)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的高度保守的非組蛋白染色體蛋白，基本組全長648bp編碼215個氨基酸殘基［１］。已有研究表明，HMGB1可由巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞等主動分泌，或
5、由壞死細(xì)胞被動釋放，從而作為一種炎癥晚期因子參與膿毒癥等病理過程［２，３］。研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)脂多糖（LPS）刺激巨噬細(xì)胞后HMGB1的分泌量較未刺激明顯增多，并且在8h～12h達(dá)峰值。而HMGB1發(fā)揮作用的機(jī)制還不是很清楚。因此，分離純化HMGB1蛋白將對進(jìn)一步研究HMGB1的生物學(xué)功能、與其他細(xì)胞因子的相互作用關(guān)系等有重要意義。本實驗以小鼠巨噬細(xì)胞RAGB1的目標(biāo)序列，構(gòu)建pMD-19T-HMGB1重組載體,亞克隆至高效表達(dá)載體pET-26b(+)，誘導(dǎo)表達(dá)并分離純化含His-標(biāo)簽肽的HMGB1融合蛋白?！ ?材料和方
6、法 1.1材料小鼠RAD-19T克隆載體購自大連寶生物工程有限公司；pET-26b(+)表達(dá)載體購自Novagen公司；TrizolRNA抽提試劑購自Invitrogen生物公司；PCR及膠中DNA回收純化試劑盒、小規(guī)模質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒購自中鼎生物技術(shù)有限公司；各種限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶及DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker購自大連寶生物工程有限公司；T4DNA連接酶購自北京紐英倫生物技術(shù)公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker購自MBIFermentas公司。引物由武漢伯杰生物技術(shù)公司合成；測序送上海英駿生物技術(shù)有
7、限公司?！ ?.2方法 1.2.1PCR引物的設(shè)計：以小鼠HMGB1cDNAGeneBank（NM010439.2）查詢的有效序列為模板，首輪PCR引物為：上游f1：5′-CGGGATCCCACTGGGCGACTCTGTGCCT-3′（引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)及兩個保護(hù)堿基），下游r1：5′-CGGAATTCTGCGCTAGAACCAACTTATTCATC-3′（引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)及兩個保護(hù)堿基）。HMGB1目標(biāo)基因的擴(kuò)增引物：上游hmgb1-f25′-CGGGATCCGATGGGCAAAGGAGATCCTAAA
8、A-3′（引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)及兩個保護(hù)堿基），下游hmgb1-r25′-CCCTCGAGTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCA-3′（引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)及兩個保護(hù)堿基)?！ ?.2.2總RNA的抽提及RT-PCR：選擇生長面積達(dá)瓶底70%的RAGB1的697bp片段，克隆至pMD-19T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)酶切鑒定及
