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1、原核表達及純化-Histag一、原核表達1.挑取一個單菌落（重組表達載體），接種到10mLLB培養(yǎng)基中（注意抗生素抗性）。37℃，過夜搖菌。2.次日，將菌液接種到1LLB培養(yǎng)基中（1:50~1:100），繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.6時（0.6~0.8），加1×IPTG誘導4h。（加IPTG前留樣（誘導前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL誘導后全菌；(2)小量表達：收集5mL誘導后全菌，12000g離心1min，裂解沉淀，分別收集上清（可溶性）和沉淀（包涵體）中的蛋白。大量表達：收集1L誘導后全菌，4
2、℃，4500g離心15~30min。二、可溶性分析目的：重組蛋白是否表達，是可溶性的還是包涵體形式。根據(jù)這個結果選擇純化方法。（1）各用30μL4×SDSLoadingbuffer重懸誘導前和誘導后的菌體（200μL）；用500μL1×BindingBuffer重懸菌體（5mL），超聲破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g離心15min，分離上清和沉淀；（2）用30μL4×SDSLoadingbuffer重懸沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL4×SDSLoadingbuffer；（4）
3、將誘導前全菌，誘導后全菌，上清蛋白和包涵體蛋白煮沸5~10min。（5）各取10μL用于SDS-PAGE檢測（12%的膠）。三、小量富集實驗樣品制備：7取5mL誘導全菌，用500μL1×BindingBuffer（8MUrea）溶解，超聲破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。4℃，19000g離心15min，取上清用于富集實驗。（留樣做SDS-PAGE）富集：1.裝柱：取30μL~50μL體積的Ni柱料（純柱料）于1.5mL離心管中。2.平衡：向離心管中加200μL1×BindingBuffer（8MUrea
4、），混勻1min，700g離心1min，去上清；重復一次。3.上樣：將制備的上清蛋白加到離心管中，混勻30min（混勻儀上）。700g離心1min，上清即為穿透（留樣做SDS-PAGE）。4.淋洗：加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，5mM咪唑），混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，10mM咪唑），混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，20mM咪唑），
5、混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；5.洗脫：加50μL1×ElutionBuffer（8MUrea，50mM咪唑），混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，3000mM咪唑），混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；6.取少量柱料做SDS-PAGE；注：用定量工作液估計蛋白的濃度：2μL待測蛋白溶液+180μL定量工作液，根據(jù)顏色的變化可以估計蛋白的濃度。對富集過程進行監(jiān)控。一、大量富集實驗樣品制備：用5
6、0mL1×BindingBuffer（8MUrea）溶解菌體，超聲破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）或者用高壓破碎儀（推薦）。4℃，19000g離心15min，取上清用于富集實驗。（留樣做SDS-PAGE）富集：1.裝柱：將1mLNi柱料裝入層析柱，7用至少三個柱體積的超純水以工作流速（每滴/3S）壓實柱料，以獲得均一的柱床，同時避免帶入氣泡。注：以下的層析操作流速不要超過裝柱流速的1.75倍。1.柱平衡：三個柱體積的1×BindingBuffer（8MUrea）平衡柱料。注：柱子掛上鎳離子后，可在Bing
7、ing溶液中過夜，4℃。2.上樣：視樣品的多少可選用LOOP或由泵直接上樣兩種方式，接穿透峰以備SDS-PAGE檢測。3.淋洗：去除非特異結合的蛋白質，接穿透峰以備SDS-PAGE檢測。10個柱體積的1×BindingBuffer（8MUrea）；6個柱體積的WASHBuffer（分別是含有10mM咪唑，20mM咪唑的1×BindingBuffer（8MUrea））；注：也可以根據(jù)定量工作液錯落估計蛋白的濃度，以確定每步的淋洗是否完全。4.洗脫：6個柱體積的1×BindingBuffer（8MUrea，50mM咪唑）；6個柱體積的
8、1×BindingBuffer（8MUrea，100mM咪唑）；6個柱體積的1×BindingBuffer（8MUrea，300mM咪唑）；留樣做SDS-PAGE；注：也可以不使用含100mM咪唑的洗脫液；至于每步用多少體積的洗脫液，可根據(jù)粗略定量
