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《病毒E蛋白的原核表達(dá)純化及初步鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
鴨坦布蘇病毒E蛋白基因的原核表達(dá)姬希文2,李雪松I,邊延峰3,李國新I,顏丕熙I,張七斤彳，李澤君I(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特010018；3?天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司，天津300384)摘要：本研究利用RT-PCR方法擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒(DuckTembusuvirus,DTMUV)奉賢株(FX2010)的結(jié)構(gòu)蛋白E基因，并將其克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E。將其轉(zhuǎn)化受體菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE和Westernblot試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，￡基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)，并且可與抗DTMUV的多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。E懇因的成功表達(dá)為DTMUV的診斷試劑盒、疫苗等的研制奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒；E基因；克隆；表達(dá)中圖分類號：文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1674-6422(2012)02-0000-00EXPRESSIONOFEPROTEINOFDUCKTEMBUSUVIRUSINPROKARYOTICCELLSJIXi-wen1'2,LIXue-song1,BIANYan-feng3,LIGuo-xin1,YANPi-xi1,ZHANGQi-jin2,LIZe-jun1(1.ShanghaiVeterinaiyResearchInstitute,CAAS,Shanghai200241.China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity.Hohhot0100189China;3.TianjinShengjiGroupCo.,Lid.,Tianjin300384,China)Abstract:TheEgeneofduckTembusuvirus(DTMUV)wasamplifiedbyRT-PCRandinsertedintothemultipleclonesitesofthepET32a(+)vector.TherecombinantplasmidwastransformedintoBL21(DE3)conipetentcellsandthecellswereinducedwithIPTGtoexpresstheEprotein?SDS-PAGEandWesternBiolassaysshowedthatheEproteinwassuccessfullyexpressedandkepttheactivityforbindingtheDTMUV-specificantibody.BasedonEproteinexpressedinprokaryoticcells,itmightbecomeeasytodevelopdiagnosiskitsandvaccinestorDTMUV.Keywords:Ducktembusuvirus;Egene;cloning;expression自2010年春季以來，中國華東地區(qū)發(fā)生了以產(chǎn)蛋下降和死亡為主要特征的鴨病的流行，之后該病迅速傳播全國多個(gè)省市，到目前為止，全國大部分主要水禽養(yǎng)殖地區(qū)仍然受到該病的威脅，發(fā)病率高達(dá)100%,病死率在5%?10%Z間。經(jīng)過病毒分離鑒定，目前已經(jīng)確定引起該病的病原為鴨坦布蘇病毒(Ducktembusuvirus,DTMUV)⑴。DTMUV屬黃病毒科黃病毒屬⑵，呈球型，直徑30?50nm,核心含單股RNA,有衣殼。從序列上分析，該病毒可能與其他黃病毒屬的病毒一樣，具有3結(jié)構(gòu)蛋白，即E蛋白、核蛋白和白蛋白為糖蛋白。其屮，E蛋白是誘發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗日木乙腦病毒中和抗體的重要抗原［習(xí)，黃病毒屬中多數(shù)病毒的E蛋白與機(jī)體宿主的免疫應(yīng)答作用密切相關(guān)，能刺激機(jī)體產(chǎn)生屮和抗體和血凝抑制抗體［“】，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久T記憶細(xì)胞，引起保護(hù)性免疫反應(yīng)。收稿日期：2012-02-23基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)儂業(yè))專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201003012)；國家國際科技合作項(xiàng)H(2010DFB33920)；屮國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所中央級公益性科研院所基木科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2010JB04)作者簡介：姬希文，女，碩上研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)通信作者：李澤君,E-mail：lizejun@shvri.ac.cn E蛋白在病毒致病過程中也起關(guān)鍵性作用，該蛋白上一些關(guān)鍵的氨基酸的替代即可引起神經(jīng)毒力和侵襲力的喪失［叫此外，E基因還與病毒吸附、侵入宿主細(xì)胞有關(guān)。本研究首次表達(dá)和純化了具有生物學(xué)活性的DTMUVE蛋白，為DTMUV早期診斷試劑盒、疫苗與E蛋白結(jié)構(gòu)功能研究奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1質(zhì)粒、pET32a(+)表達(dá)載體和JM109、BL21(DE3)宿主菌為本試驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶、和T4DNA連接酶為NEB公司；pMD19-T>Ex^gDNA聚合酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司；鼠源多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為KPL公司。1.2引物設(shè)計(jì)根據(jù)DTMUV奉賢株(FX2010)E基因序列(GenBank:HQ833330.1),利用primer5軟件設(shè)計(jì)一對E基因的特異性引物，預(yù)擴(kuò)增片段長大約1500bp,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,其序列如下:DTMUV-E^RI-UP(上游引物)：5LCACACQAAUCCGAGACTTTGTTGAGGGAGTGAAT?3，DTMUV-X局I-DOWN(下游引物)：5*-CACACCTCGAGGACATGGATATGGGAACTCTACA31.3DTMUVE基因片段的PCR擴(kuò)增以提取的DTMUV奉賢株RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR,操作方法和反應(yīng)條件如下：以5gLRNA為模板，2gLRandom(TaKaRa公司)為引物，70°C保溫10min,迅速冰浴2min,然后分別加入4pL5xM?MLVbuffer、lyLRRl、1|1LM-MLV(TaKaRa公司)、1gLlOmmol/LdNTP、6pLDEPC水，共20gL,混勻后30°C保溫10min,42°C水浴1min,75°C10min；將得到的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性5min；94°C變性50s,53°C退火lmin；72°C延仲1min30s,30個(gè)循環(huán)；72°C再延仲15min,10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，回收冃的片段。1.4目的基因的克隆與鑒定將回收的PCR產(chǎn)物克降入pMD19-T載體上，連接反應(yīng)體系為：pMD19?TlyL、冃的DNA片段4pL和SolutionI5|.iL；16°C連接2h后，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG和X?gal的氨節(jié)平板上，37°C恒溫培養(yǎng)12?16h,挑取單個(gè)白色菌落接種于含氨節(jié)的液體培養(yǎng)基中，37°C220r/min振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切鑒定正確后，將陽性克隆送上海英俊公司測序。1.5重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將測序正確的pMD19T-E陽性質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET32a(+)分別用EcoRI和雙酶切，分別回收酶切后冃的片段與線性化后的pET-32a(+),加入T4-DNA連接酶于16°C連接過夜，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞；挑取單菌落進(jìn)行PCR、酶切鑒定。2結(jié)果2.1PCR擴(kuò)增DTMUVE基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后可見一條約1500bp的條帶，與預(yù)期片段大小相符(圖1)，并且測序結(jié)果與目的序列一致。 bpM2200010007505002501001500圖1鴨坦布蘇病毒E基因的PCR擴(kuò)增Fig.lPCR-amplifiedEgenefromDTMUVM:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1:E基因的PCR產(chǎn)物；2:陰性對照M:DNAMarker(DL2000);1:PCRproductsofEgene;2:Negativecontrol2?2重組表達(dá)載體的構(gòu)建將測序正確的片段與表達(dá)載pET32a(+)連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),挑單菌落培養(yǎng)后，用XhoI和EcoR1雙酶切鑒定，可見2條大小分別為5900bp和1500bp左右的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2),將該重組質(zhì)粒命名為pET32a-EoOOOOoooo005050750095250010002501500圖2pET32a-E的酶切鑒定Fig.2IdentificationoftherecombinantplasmidpET32a-EbyrestrictionenzymesdigestionM:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1:pET32a-E雙酶切產(chǎn)物M:DNAMarker(DL2000);1:pET32a-E3討論鴨坦布蘇病毒(DTMUV)與西尼羅病毒(Westnilevirus,WNV)、登革病毒(Denguevirus,DV)同屬黃病科黃病痔屬成員，推測其E蛋白有著與其他黃病毒E蛋白有著相似的結(jié)構(gòu)和功能oKolaskar等⑺9】的研究表明，E蛋白含有3個(gè)抗原域：域I,也稱為中心域，由E1位?E51位、E137位?E196位和E293位?E311位的130個(gè)氨基酸殘基組成，此域有糖基化位點(diǎn)和具有血清學(xué)及生物學(xué)活性的抗原表位；域II,由E52位?E136位和E197位?E292位的181個(gè)氨基酸殘基組成，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；域III,由E312位?E411位的100個(gè)氨基酸殘基組成，參與受體結(jié)合過程,在黃病毒屬中十分保守〔⑼。決定毒力的基因片段主要集屮在E蛋白編碼區(qū)，E蛋白是病毒表面棘突的主耍成分，它可激發(fā)中和抗體和保護(hù)性免疫，一般認(rèn)為它是病毒受體的結(jié)合蛋白，并介導(dǎo)膜融合和細(xì)胞穿入。 本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出了DTMUV完整E蛋白基因片段[⑴，含有形成高級結(jié)構(gòu)所需的所有元件。為了分析原核表達(dá)的E蛋白的生物學(xué)特性，建立安全、簡便和經(jīng)濟(jì)的制備DTMUV診斷抗原的方法，筆者構(gòu)建了DTMUV-E表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)。由于大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3pLysS+)的轉(zhuǎn)化效率相對較低，所以按pET系列載體克隆操作說明的方法，先把目的基因和載體的連接產(chǎn)物克降入大腸桿菌JM109中，篩選出重組質(zhì)粒后，再把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3),最后成功地在大腸桿菌中表達(dá)了E蛋白。DTMUV的E蛋片在病毒與敏感細(xì)胞結(jié)合過程中起著重要的作用，DTMUV敏感細(xì)胞表面有病毒的相應(yīng)受體，但其結(jié)構(gòu)和功能尚未明確。我們用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)E蛋白，在多次嘗試不同表達(dá)載體與宿主菌之后，成功的構(gòu)建了E蛋白的原核表達(dá)載體。對原核表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析結(jié)果表明，表達(dá)的E蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體裂解后的沉淀中。本研究中E蛋白表達(dá)量始終偏低，誘導(dǎo)表達(dá)過程中，相同條件下，轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒載體細(xì)菌的生長速度，明顯高于轉(zhuǎn)入E基因重組質(zhì)粒載體細(xì)菌的生長速度，這可能是E蛋白對細(xì)菌細(xì)胞有一定毒性有關(guān)，今后仍需要優(yōu)化誘導(dǎo)條件和插入片段的長度等，來提高E蛋白表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)用原核表達(dá)系統(tǒng)，在國內(nèi)外首次成功表達(dá)了具有良好反應(yīng)活性的DTMUVE蛋白，這為DTMUV的診斷、抗原性分析及功能研究提供了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)[1]YanP,ZhaoY,ZhangX,elal.AninfectiousdiseaseofduckscausedbyanewlyemergedTembusuvirusstraininmainlandChina[J].Virology,2011,417(1):1-8.[2]LiY,YcJ,CaoS,etal.ImmunizationwithpscudotypcbaculovirusexpressingenvelopeproteinofJapaneseencephalitisviruselicitsprotectiveimmunityinmice[J].JGeneMed,2009,11(2):150-159.[3]LiP,ZhengQS,WangQ,et?/.ImmuneresponsesofrecombinantadenovirusesexpressingimmunodominantepitopesagainstJapaneseencephalitisvirus[J].Vaccine,2008,26(46):5802-5807.[4]吳玉水?基因工程重組乙型腦炎病毒E蛋門作為候選疫苗和診斷抗原的實(shí)驗(yàn)研究[D].第四軍供大學(xué)博士學(xué)位論文,2003.[5]ModisY,OgataS,ClementsD,et^//.Variablesurfaceepitopesinthecrystalstructureofdenguevirustype3envelopeglycoprotein[J],JVirol,2005,79(2):1223-31.[6]NybakkenGE,NelsonCA,ChenBR,etal.CrystalstructureoftheWestNilevirusenvelopeglycoprotein[J].JVirol,2006,80(23):H467-11474.[7]StiasnyK,KosslC,LcpaultJ,etal.CharacterizationofaStructuralIntermediateofFlavivirusMembraneFusion[J]?PLoSPathog,2007,3(2):20[8]SambrookJ,FritschEF,Maniatis,T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].2版,金冬雁,黎孟楓,譯,北京：科學(xué)出版社,1989,49-56,845-848,876-887.[9]WangJW,FuSH,WangHY,etal.IsolationandidentificationofJapaneseencephalitisvirusinLiaoningprovincc[J]?|4華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2006,20(1):61-65.[10]VermaSK,GuptaN,PattnaikP,etal.Antibodiesagainstrefoldedrecombinantenvelopeprotcin(domainIII)ofJapanesecnccphalitisvirusinhibittheDTMUVinfectiontoporcinestablckidneycclls[J].ProteinPeptLett,2009,16(11):1334-1341.[11]呂曉麗，崔保安，陳紅英，等.復(fù)合RT-PCR檢測豬乙腦病毒和豬流感病毒方法的建立[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，200&29(4):79-82.[12]VermaSK,KumarS,GuptaN,etal.BactcriallyexpressedrccombinantenvelopeproteindomainIIIofJapaneseencephalitisvirus(rDTMUVDIII)elicitsTh1typeofimmuneresponseinBALB/cmice[J].Vaccine,2009,27(49)：6905-6909.[13]NabeshimaT,LoanIIT,InoneS,etal.EvidenceoffrequentintroductionsofJapaneseencephalitisvirusfromsoutheastAsiaandcontinentaleastAsiatoJapanfJ].JGenViro,2009,90(Pt4):827-832.
