乙腦病毒e蛋白的原核表達(dá)、純化及初步鑒定論文

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1、乙腦病毒E蛋白的原核表達(dá)、純化及初步鑒定論文高淑嫻，張偉，任君萍，雷迎峰，丁天兵，宋建華，馬文煜，徐志凱【Abstract】AIM:ToconstructgeneencodingJapaneseencephalitisvirus(JEV)envelopeglycoproteinandtoexpressEproteininBL21(DE3).METHODS:UsingRTPCR,thegeneencodingEproteinplified.ThegeneidpET286HisEedintoBL21(DE3).The6HisEproteinexpressedinBL21(E

2、D3)inedbySDSPAGEand.E蛋白為糖蛋白，包裹在病毒的表面，它決定著病毒的毒力及其宿主范圍，不僅在與宿主細(xì)胞受體結(jié)合及隨后的膜融合中發(fā)揮重要作用，而且可刺激產(chǎn)生中和抗體［2］.我們對E蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)、純化及鑒定，為進(jìn)一步研究病毒的受體和病毒的感染機(jī)制提供了有利條件.1材料和方法1.1材料pET28a(+)表達(dá)載體和XL10,BL21(DE3)宿主菌為本試驗(yàn)室保存.P1，P2引物合成及序列測定由三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成；限制性內(nèi)切酶、PMD18T，EXTaq聚合酶和連接試劑盒（寶航公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）；JEV鼠源性mA

3、b和兔源多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備；猴抗鼠紅外標(biāo)記二抗、羊抗兔紅外標(biāo)記二抗（Rockland公司）；紅外成像系統(tǒng)（LICOR公司）；高速低溫離心機(jī)（BECKMAN公司）；恒溫?fù)u床（上海智城公司）.1.2方法1.2.1片段的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建用Trizol提取JEVRNA，以8μLRNA為模板,1μLP1為引物,1μLdNTP65℃水浴5min,冰浴1min,2μL10×RT緩沖液,4μL25mmol/LMgCl2,.freelin；加1μLsuperscriptTM混勻；42℃水浴50s；70℃水浴15min；加1μLRAaseH混勻；37℃水浴20min；將得到的產(chǎn)物進(jìn)行P

4、CR擴(kuò)增，5′端引物：5′CGCTCGAGTTAAGCATGCATTGGTCGCTAA3′；3′端引物：5′CGGAATTCTTTAATCGTTGTCTGGGAATGGGCAATCGTGAC3′.反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃50s；55℃1min；72℃1min30s,30個循環(huán)，72℃15min.10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的片段.將回收的PCR產(chǎn)物克隆入PMD18T載體中轉(zhuǎn)化EcoliE..XL10感受態(tài)細(xì)胞，EcoRⅠ和XholⅠ酶切鑒定，陽性克隆送公司測序；測序正確后，EcoRⅠ和XholⅠ雙酶切PMD18TE質(zhì)粒和表達(dá)載體pET2

5、8a,回收目的片段,連接；轉(zhuǎn)EcoliE..XL10感受態(tài)細(xì)胞；挑克??；提取質(zhì)粒；酶切鑒定載體構(gòu)建.陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)；提取質(zhì)粒；酶切鑒定；陽性克隆保留菌種.1.2.2工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析用載體構(gòu)建成功的菌種劃抗性平板，挑取單克隆在37℃培養(yǎng)至A600nm為0.4～0.6，加入100mg/LIPTG誘導(dǎo)4h.1000r/min,4℃10min離心收菌.棄上清后用PBS洗菌體，用去離子水重懸菌體.加入2×SDS上樣緩沖液進(jìn)行樣品處理.另離心收集菌體，以溶液STE(50mmol/LTris﹒Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA,100mmo

6、l/LNaCl)重懸菌體，超聲破菌（間隔10s,超聲8s,共15min）.分別收集上清和沉淀，上清用5×SDS上樣緩沖液處理，沉淀用1×SDS上樣緩沖液處理后徹底重懸.取上述各樣品做SDSPAGE用2.5g/L考馬斯R25溶液室溫染色2h后脫色.1.2.3重組蛋白的鑒定同上取上清和沉淀樣品分別進(jìn)行處理并做SDSPAGE，隨后將電泳蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上（轉(zhuǎn)移緩沖液：甘氨酸39mmol/L,Tris堿48mmol/L,SDS3.7mg/L,甲醇200ml/L），100V轉(zhuǎn)移80min后用25mmol/LTBS平衡NC膜10min,用0.5g/L的脫脂奶4℃封閉5h，用TBS·T

7、洗膜3次,10min/次，1∶200稀釋JEV鼠源性mAb，1∶100稀釋JEV兔源性多抗，4℃孵育過夜，然后用TBS·T洗膜3次，10min/次，再與1∶2500稀釋的猴抗鼠抗體和羊抗兔抗體分別孵育，4℃作用90min后洗膜3次，10min/次，然后進(jìn)行掃描分析.1.2.4重組蛋白的純化參照Qiagen公司鎳離子親和層析柱（NiNTA）操作說明進(jìn)行.離心收集500mL誘導(dǎo)宿主菌，冰浴15min；按5mL/g濕菌的比例加入含8mol/L尿素的緩沖液B(pH8.0),室溫下輕輕攪拌使細(xì)菌裂解