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《豬瘟病毒E2蛋白的原核表達(dá)與純化及多克隆抗體制備》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、論文答辯日期梁晶晶學(xué)科專業(yè)亟隨獸醫(yī)堂指導(dǎo)教師星廷苤?jǐn)?shù)援2010．06．06學(xué)位授予日期答辯委員會主席整玉曩硒究員論文評閱人蔓窆民數(shù)援蕉掛羞塾援本人聲關(guān)知識產(chǎn)權(quán)的研究內(nèi)容本人為獲得其它學(xué)位而使用過的內(nèi)容。對本文的研究工作提供過重要幫助的個(gè)人和集體，均已在論文中明確說明并致謝。論文作者簽名：一一漿‰、孫學(xué)位論文使用授權(quán)說明W緲年占月，p日本人完全了解廣西大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本：學(xué)校有權(quán)保存學(xué)位論文的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務(wù)；學(xué)?？梢圆捎糜坝?、縮印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存論文；在不以贏利為目的
2、的前提下，學(xué)?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉績?nèi)容。請選擇發(fā)布時(shí)間：幽／時(shí)發(fā)布口解密后發(fā)布(保密論文需注明，并在解密后遵守此規(guī)定)敝儲簽鋤燧名：、磷叼刖月tv豬瘟豬瘟是一種以嚴(yán)重出血為特征、高度接觸感染性的動物疫病，能夠?qū)е仑i群的大量發(fā)病和死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。E2囊膜糖蛋白是豬瘟病毒中相當(dāng)重要的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其不僅參與了病毒的感染致病過程，還是病毒的主要保護(hù)性抗原，能夠誘生特異性的中和抗體清除病毒。因此，對E2蛋白結(jié)構(gòu)和功能的探索一直是豬瘟病毒研究的重點(diǎn)之一。本文根據(jù)己發(fā)表豬瘟病毒兔化弱毒株的E2基因序列，設(shè)計(jì)引物利用RT-PCR方法擴(kuò)增了E2基因的主要抗原結(jié)構(gòu)
3、域E2a，并將其克隆至pMDl8一T載體，再亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-E2a。將pET-E2a轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL一21(DE3)與Rosetta(DE3)中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS．PAGE與Westernblot檢測，證實(shí)為E2a重組融合蛋白。E2a重組蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達(dá)，而Rosetta(DE3)菌株中的蛋白表達(dá)量顯著高于BL．21(DE3)菌株。所得包涵體溶解后經(jīng)鎳離子金屬螯合親和層析法進(jìn)行純化，純化蛋白以逐步透析法進(jìn)行復(fù)性重折疊，通過Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)復(fù)性蛋白可被豬瘟陽性血清識別，具
4、備良好的抗原性。以復(fù)性E2a重組蛋白制備抗原免疫動物，獲取了多克隆抗體。免T疫斑點(diǎn)實(shí)證實(shí)針對細(xì)胞中天性。關(guān)鍵詞：CSFVE2蛋白原核表達(dá)親和層析純化多克隆抗體IIglycoproteinisoneoftheimportantstructuralproteinsofCSFV．TheE2isnoonlythemaintargetforneutralizingantibodiesbutalsorefertoCSFVinfectionandpathogenicity．Thus，theknowledgeabouttheE2isthemainpointsofresearchcon
5、cernedwithCFSVTheantigenicregionsinE2gene(E2a)ofCSFVHCLVstainwasamplifiedbyRT-PCRandclonedintopMD18一Tvector,andthensubsequentclonedintopET-32aprokaryoticexpressionvector,obtainedarecombinantplasmidpET-E2a．ThentransformedpET-E2aplasmidintoE．coliBL-21(DE3)andRosetta(DE3)．TheE2aproteinsexp
6、ressedinE．coliwasverifiedbySDS-PAGEandwesternboltanalysisafterinductionbyIPTGThefusionproteinexpressedinE．coliwasasaformIIIofinclusionbody．ItwasshowedthatRosetta(DE3)hadexcellenterexpressionabilitythanBL21(DE3)．TherecombinantE2aproteinwaspurifiedviaNi-chelatinghistrapaffinitycolumnandth
7、enrefoldedit．TherefoldedE2aproteinscouldbedetectedbyswineanti-CSFVserumusingwestemblotanalysis．TheE2arecombinantproteinwasusedasallantigentoimmunizethemice．PolyclonalantibodyagainstE2awaspreparedafterimmunizedmiceforfourtimes．ThetiterationpolyclonalantibodyagainstE2awasdetermin
