重組鼠il28的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備

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1、重組鼠IL28的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備：袁利學(xué)，劉洋，步雪峰，鄭金旭，嚴(yán)玉蘭【摘要】目的：獲取重組鼠IL28（mIL28）純化蛋白,制備多克隆抗體。方法：用PCR技術(shù)擴(kuò)增鼠IL28成熟蛋白的編碼序列，克隆入原核表達(dá)載體pET30，構(gòu)建融合表達(dá)載體pET30amIL28，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)IL28融合蛋白，經(jīng)鎳柱親和層析純化，然后免疫6～8周齡雞,制備多克隆抗體，采用ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。結(jié)果：成功構(gòu)建了表達(dá)載體pET30amIL28，DNA序列測(cè)定結(jié)果與預(yù)期結(jié)

2、果一致。在37℃培養(yǎng)條件下，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的IL28融合蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)其與融合蛋白的理論計(jì)算值一致，免疫雞后收獲抗血清,ELISA顯示抗體效價(jià)具有高度特異性。結(jié)論：獲得了重組鼠IL28純化蛋白,制備了鼠IL28多克隆抗體，為進(jìn)一步深入研究IL28的生物活性及其應(yīng)用打下基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】白細(xì)胞介素28；大腸埃希菌；蛋白質(zhì)純化；抗體制備　?。跘bstract］Objective:Toobtainpurifiedrebinantinterleukin28ofmouse(mIL28)andprepa

3、reitspolyclonalantibody.Methods：ThecDNAfragmentcodingformaturemIL28proteinplifiedbyPCRandclonedintovectorpET30toconstructfusionexpressionvectorpET30amIL28.AfterpET30amIL28edintoE.coliBL21(DE3),thebacteriaIL28fusionproteinatography.Sixtoeightmunized.Thetiters

4、ofantibodieseasuredbyELISA.Results：TheDNAsequencingshoIL28IL28fusionproteininE.coliculturedat37℃appearedasinglebandonSDSPAGE．TheresultofELISAindicatedthatthepreparedpolyclonalantibodyhadhightiterandspecificity.Conclusion：Thepurifiedrebinantinterleukin28ofmouseand

5、polyclonalantibodyhavebeenacquired.　?。跭eyIL28由本室構(gòu)建；E．coliNovaBlue，E.coliBL21(DE3)均由本室保存；實(shí)驗(yàn)用6～8周齡雞由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NeIL28為模板，上游引物：TTGAATTCCCTGTCCCCAGGGCCACCAG，下游引物:CTCGAGTCAGACACACTGGTCTCCACTGGCCACACAC，上游引入EcoRⅠ位點(diǎn)，下游引入XhoⅠ位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增鼠IL28的成熟蛋白序列，PCR循環(huán)條件為：95℃熱啟動(dòng)

6、預(yù)變性5min,95℃30s，64℃30s，72℃50s,共30循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,膠回收試劑盒回收。用T4DNA連接酶將上述PCR產(chǎn)物與PMD18TVector連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5a。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后測(cè)序。將PMD18TVectormIL28鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒及原核表達(dá)載體pET30分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切處理，回收片段與載體，用T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5a。取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后

7、進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鑒定，酶切產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析?！　?.2.2工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)　　將重組陽(yáng)性質(zhì)粒pET30amIL28轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)BL21中，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中（卡那霉素終濃度100μg/ml），于37℃活化過(guò)夜（14～16h）后，按1∶100的比例接菌，即50μl加入含5ml的LB的試管中（卡那霉素終濃度100μg/ml），37℃振蕩培養(yǎng)約3h至D(600nm)值為0.4～0.6時(shí)，加入1mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)3h。取菌體1ml,離心12000×g30s收獲沉淀，用

8、100μl1%SDS重懸，混勻,煮沸10min。12％SDSPAGE電泳分析，電泳完畢后，用0.25%考馬斯亮藍(lán)染色液染色2h，脫色，觀察電泳結(jié)果，蛋白質(zhì)大小參照低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)?！　?.2.3重組鼠IL28成熟蛋白的純化　　取培養(yǎng)過(guò)夜的工程菌1∶100稀