人SUMO2基因原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備

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1、人SUMO2基因原核表達(dá)、純化及多克隆抗體制備【摘要】目的：構(gòu)建人SUMO2基因的原核表達(dá)載體，純化融合蛋白GSTSUMO2SUMO2并以其為抗原免疫家兔，制備人SUMO2多克隆抗體。方法：用PCR的方法得到人SUMO2基因并克隆至pET41a(+)原核表達(dá)載體屮，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS誘導(dǎo)融合蛋白GSTSUM02SUMO2表達(dá)；所獲得的可溶性蛋白經(jīng)親和層析純化、SDSPAGE電泳鑒定后，免疫家兔制備抗血清，分別采用ELISA、Westernblot檢測抗體效價(jià)和特異性。結(jié)果：測序證實(shí)重組質(zhì)粒pET41a(+)

2、SUM02SUMO2構(gòu)建成功;SDSPAGE結(jié)果證實(shí)獲得Mr為52000的GSTSUMO2SUMO2融合蛋白且為可溶性蛋白；經(jīng)過GST親和層析有效純化；以該融合蛋白免疫家兔制備得到的抗血清經(jīng)Westernblot檢測證實(shí)能與目的蛋口發(fā)生特異性結(jié)合，ELISA檢測為陽性。結(jié)論：獲得了人SUMO2蛋白及特異性多克隆抗體，對進(jìn)一步研究人SUMO2及SUMO第二類家族的功能提供了有用工具?！娟P(guān)鍵詞】人SUMO2原核表達(dá)蛋白純化抗血清隨著2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予給發(fā)現(xiàn)了泛索調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解的以色列科學(xué)家阿龍?切哈諾沃、阿夫拉姆?赫什科和

3、美國科學(xué)家歐文?羅斯，近年來，對依賴于泛素及類泛素蛋白的翻譯后修飾的研究成為了新的熱點(diǎn)。其中，小泛素相關(guān)修飾物(smallubiquitinrelatedmodifier,SUMO）與蛋口的共價(jià)連接是一種新的廣泛存在的翻譯后修飾形式，并且在真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)修飾中具有重耍意義。哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)4種SUMO分子：按發(fā)現(xiàn)順序稱為SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。與泛素類似，SUMO也是通過與靶蛋白的結(jié)合起作用的，但與泛素化介導(dǎo)的蛋白酶降解途徑不同，SUMO化的結(jié)果并不是將蛋白分子降解，而是通過修飾來增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或者調(diào)節(jié)

4、其亞細(xì)胞定位，以及影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮更加廣泛的功能，比如核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期調(diào)控以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［1］。目前為止，我們知道的SUMO化修飾的底物還只是一小部分被明確鑒定，而且我們對己知的SUMO化修飾在改變許多蛋白的穩(wěn)定性、定位、活性等的機(jī)理和功能上還存在很多疑問。尤其是對SUMO2/3的具體作用及其與SUMO1在功能上的差異還知之甚少，因而我們通過構(gòu)建SUMO2的原核表達(dá)載體，獲得GSTSUMO2融合蛋白并進(jìn)行純化，由此得到人SUMO2的特異性多克隆抗體，為進(jìn)一步研究SUMO2的功能及其與家族其他成員的差異打下了良好的

5、基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料質(zhì)粒PET41a（+）、大腸桿菌DH5a、BL21（DE3）plysS（本實(shí)驗(yàn)室保存），pEYPFSUMO2（雷鳴教授惠贈(zèng)），新西蘭大口兔（體質(zhì)量2.5-3.0kg）2只。小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒均為博大泰克公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶Noel及XhoI,T4連接酶、TagDNA聚合酶、pfuDNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量（MR蛋白均購自大連TaKaRa有限公司；IPTG購自北京索萊寶科技有限公司；卡那霉素購口北京鼎國生物工程公司；硝酸纖維素膜為徳國Whatman公司產(chǎn)品；小鼠GST單克隆抗

6、體（mAb）、HRP標(biāo)記的羊抗兔、兔抗鼠抗休購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；GSTbindcolumn購自Amersham公司;凝血酶購自Sigma公司;其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。1.2方法1.2.1引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank（GenbankID:NM_006936）中人SUMO2基因cDNA序列，克隆其ORF中活性蛋白區(qū)域即其162bp至441bp序列，設(shè)計(jì)合成兩對引物，引物序列如下,第一對上游引物P1:5’CCGCCATGGGAATGTCCGAGGAGAAG3’;下游引物P2:5’TATGGATCCACCTCCC

7、GTCTGCTG3’;其中上游引物含有NeoI限制性酶切位點(diǎn)，下游引物含有BamllI限制性酶切位點(diǎn)。第二對上游引物P3:5’TTCGGATCCATGTCCGAGGAGAAG3,;下游引物P4:5'TATCTCGAGTTAACCTCCCGTCTGCTG3,;其屮上游引物含有BrnnHI限制性酶切位點(diǎn)，下游引物含有XhoT限制性酶切位點(diǎn)。另為做重組質(zhì)粒檢測用，又合成了PET41a（+）的通用引物S.Tagprimer#699453（記做Ps）:CGAACGCCAGCACATGGACAGCT7terminatorprimer#693

8、373（記做Pt）:ACCGCTGAGCAATAACTAGCA引物合成由上海英俊生物工程公司完成。1.2.2人SUMO2基因原核表達(dá)載體pET41a(+)SUM02SUMO2的構(gòu)建以pEYFPSUMO2質(zhì)粒為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性3