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《qki蛋白的原核表達(dá)、 純化及其多克隆抗體的制備與鑒定 》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、QKI蛋白的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備與鑒定黃博,于芳,王孝功,白麗圓,李華,盧茲凡【關(guān)鍵詞】QKI 〔摘要〕目的:獲得原核表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白QKI7蛋白,并制備其兔抗QKI多克隆抗體。方法:將成功插入QKI7編碼區(qū)cDNA的PET32b(+)原核表達(dá)載體用熱休克法轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌,以IPTG誘導(dǎo)6×HisQKI7融合蛋白的表達(dá),分別經(jīng)金屬鰲合柱、反向柱和強(qiáng)陰離子交換柱進(jìn)行層析純化。經(jīng)SDSPAGE和ory大學(xué)藥理系教授馮越惠贈。Ni金屬鰲合柱（SepharoseFastFloacia公司。
2、純種新西蘭白兔由本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供。弗氏佐劑購自GibcoBRL公司。HepG2細(xì)胞、Hy906細(xì)胞為本室保存的引自美國ATCC的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株?！ ?.2方法 1.2.1細(xì)菌的發(fā)酵和裂解將6×His融合表達(dá)載體PET32b(+)QKI7轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)接到5mL的LB培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)過夜,轉(zhuǎn)接細(xì)菌到500mL2×YT培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)10h無菌接種于30L發(fā)酵罐中（內(nèi)有8L培養(yǎng)液,不含抗生素）37℃培養(yǎng)6h后開始流加補(bǔ)料,9h后加入IPTG至終濃度05mmol/L開始誘導(dǎo),誘導(dǎo)4h后停止發(fā)酵。4
3、000r/min離心25min,收集沉淀,-70℃保存?zhèn)溆?。取發(fā)酵細(xì)菌,按照細(xì)菌和裂解液為1∶8的比例加入裂解(20mmol/LTrispH10,3mL/L巰基乙醇,6mol/L鹽酸胍),不停攪拌,室溫過夜。8000r/min離心30min,收集上清;然后用超聲波發(fā)生器以1500mol/LTrisHClpH80,150mmol/LNaCl,6mol/L脲)平衡后,取第一步準(zhǔn)備的上清直接采用金屬鰲合柱層析。上樣流速為8mL/min;上樣完成后用A液流洗至基線,直接用B液(20mmol/LTrisHClpH80,150mm
4、ol/LNaCl,6mol/L脲,200mmol/L咪唑)洗脫,收集目的蛋白峰,準(zhǔn)備下一步反相層析純化?！ ?.2.3反相層析純化QKI7以8mL/min的流速用B液(20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L巰基乙醇,5mol/L脲,500mL/L異丙醇)流洗30mL,然后用A液(20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L巰基乙醇,5mol/L脲)平衡層析柱至基線,調(diào)整紫外吸收至零點(diǎn)。用8mL/min的流速上樣,上樣結(jié)束后用A液流洗至基線,采用20%B液流洗2個柱體積,收集蛋白峰,記為peak1,再用
5、75%B液洗脫2個柱體積,收集蛋白峰,記為peak2,最后用100%B液洗脫2個柱體積,收集蛋白峰,記為peak3。電泳鑒定發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在于peak2中。收集peak2,準(zhǔn)備陰離子柱純化。 1.2.4強(qiáng)陰離子層析純化QKI7以8mL/min的流速用B液(20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L巰基乙醇,5mol/L脲,1mol/LNaCl)流洗30mL,然后用A液(20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L巰基乙醇,5mol/L脲)平衡層析柱至基線,調(diào)整紫外吸收至零點(diǎn)。用8mL/min的流速上樣,
6、上樣結(jié)束后用A液流洗至基線,采用7%B液流洗2個柱體積,收集蛋白峰,記為peak1,再用20%B液洗脫2個柱體積,收集蛋白峰,記為peak2,最后用100%B液洗脫2個柱體積,收集蛋白峰,記為peak3。電泳鑒定發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在于peak2中,純度在95%左右,4℃保存?zhèn)溆??！ ?.2.5抗原的Ab(1∶1000稀釋),二抗為羊抗鼠HRPIgG（1∶500稀釋）,依次加DAB和H2O2顯色?！ ?.2.6抗體的制備將6只新西蘭大白兔隨機(jī)分成3組,用純化的6×His融合蛋白分別以弗氏佐劑、聚丙烯酰胺凝膠、NC膜作為佐劑常
7、規(guī)免疫,每次免疫PET32b(+)QKI7融合蛋白200μg。首次免疫后1月進(jìn)行第2次免疫,其后間隔2周進(jìn)行第3次免疫,共3次。其中弗氏佐劑組第1,第2次免疫分別用完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑及200μg抗原等體積混合,于腋下和腹股溝區(qū)注射,第3次免疫用200μg純抗原于耳緣靜脈直接注射。聚丙烯酰胺凝膠和NC膜組3次免疫均為腋下和腹股溝區(qū)注射。3組最后1次免疫2周后,從兔耳靜脈采血1mL,以間接ELISA法檢測血清抗體效價,其中弗氏佐劑組抗體效價高于1∶105,聚丙烯酰胺凝膠組和NC膜組抗體效價低于1∶102,頸動脈插
8、管分別收集血清。血清在4℃孵育過夜,離心收集上清,分裝凍存于-70以備用?！ ?.2.73種不同的免疫策略抗體特異性的鑒定用過表達(dá)QKI7的HepG2細(xì)胞蛋白提取進(jìn)行SDSPAGE后,電轉(zhuǎn)移至NC膜上,以100g/L脫脂奶粉封閉過夜,用3組抗QKI血清(1∶700稀釋)進(jìn)行r約40000的蛋白帶(圖1),與預(yù)期的6×HisQKI7
