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《Snail／GST融合蛋白的原核表達及其多克隆抗體制備》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、?？妻k學點教育技術(shù)專業(yè)課程培養(yǎng)方案思考《國家中長期教育改革和發(fā)展規(guī)劃綱論文聯(lián)盟要》指出,“信息技術(shù)對教育發(fā)展具有革命性影響，必須予以高度重視”，“提高教師應用信息技術(shù)水平，更新教學觀念，改進教學方法，提高教學效果。鼓勵學生利用信息手段主動學習、自主學習，增強運用信息技術(shù)分析解決問題能力?！彪S著教育信息化進程的推進，培和方法主要試劑和菌株主要試劑購自北京中山公司；大腸桿菌DH5a和BL21由北京大學臨床腫瘤學院北京市腫瘤防治研究所細胞實驗室保存。pGEX4T1/Snail原核表達載體的克隆從人血管內(nèi)皮細胞提取總RNA,在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成cDNAo以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板
2、，用上游引物5’CTGCAGGACTCTAATCCAG3'和下游引物5’ATCCTTGGCCTCAGAGAGC3’,進行PCR擴增，得到SnailC末端377bp的DNA片斷；酶切、瓊脂糖凝膠電泳分離后，用玻璃奶法純化回收，與pGEX4T1原核表達載體定向連接。轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌，提取質(zhì)粒并酶切鑒定重組體。融合蛋白的誘導表達與純化表達鑒定表達質(zhì)粒Snai1/pGEX4T1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后，經(jīng)過酶切鑒定，挑取陽性細菌克隆至3mlLB/Amp+試管中培養(yǎng)3?5h。SDSPAGE分析融合蛋白的誘導表達情況?？扇苄澡b定離心誘導菌液，收集菌體，以PBS重懸，加細菌裂解液混
3、勻，冰浴。加入TritonX100至終濃度為1%,冰浴。冰上以20Hz間歇超聲裂解。再離心并分別收集上清和沉淀，進行SDSPAGE,證實融合蛋白以包涵體形式存在。純化加5倍體積超聲緩沖液懸浮沉淀，冰上間歇超聲30s,離心棄上清。重復3?4次。沉淀加等體積SDSPAGEloadingbuffer,超聲重懸，沸水煮5min后上樣，100V電泳6?7h。用冷浸泡膠，切下目的條帶放入透析袋內(nèi)。將透析袋置于水平電泳洗脫裝置內(nèi)，60V洗脫過夜，次日100V繼續(xù)洗脫lh,然后反轉(zhuǎn)電極向相反方向洗脫3?5mino吸出透析帶內(nèi)液體，蔗糖包埋濃縮，PBS透析。行SDSPAGE定量，即獲得純化
4、的融合蛋白?？筍nail多克隆抗體的制備抗原為原核表達并經(jīng)SDSPAGE膠純化的GST/Snai1融合蛋白，免疫新西蘭白兔。取耳血，用ELISA法測定抗體效價，當效價達到10-5時，放血，收集血清?？贵w效價和特異性免疫學鑒定酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測抗體滴度：觀察結(jié)果并用ELISAReader測0D490nmoWesternBlot鑒定抗體SDSPAGE分析融合蛋白的誘導表達情況。2結(jié)果Sna訂/pGEX4T1原核表達載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果以Snail全長為模板，PCR大量擴增出Snail片段，經(jīng)鑒定在約400bp處有條帶擴出，與推算值相符；將目的片段裝入pGEX4T1原核表達載
5、體后，酶切鑒定正確，在近400bp處有條帶釋放。融合蛋白GST/Sna訂的誘導表達和純化經(jīng)純化的GST/Sna訂融合蛋白只有一條蛋白帶。2.3Sna訂多克隆抗體活性鑒定ELISA鑒定經(jīng)制備型SDSPAGE進一步純化的融合蛋白GST/Snail免疫新西蘭兔獲得抗血清，ELISA實驗結(jié)果表明，其效價為5X105oWesternBlot鑒定抗體Snail/pGEX4T1感染的細胞在近40KD處出現(xiàn)條帶。3討論本課題通過基因工程手段原核表達Snail竣基端的GST融合蛋白[3],然后免疫新西蘭兔獲得效價高、特異性強的抗Sna訂抗體，與一些進口抗體相比造價低，且適用于免疫熒光、石蠟
6、切片等[4],為深入研究其功能和探討其與腫瘤等疾病的相關(guān)性提供了工具。我們利用該抗體研究了宮頸不同組織學階段的蠟塊標本，Snaill表達的免疫組織化學反應在宮頸癌中呈上升趨勢，陽性表達率為％,與正常及非典型增生組差別明顯，證明Snail與癌分化程度相關(guān)。表明了Sna訂是腫瘤進展過程中浸潤的一個重要的調(diào)節(jié)因素[5],為今后進一步揭示腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移開創(chuàng)了新的途徑和工具?！緟⒖嘉墨I】[1]CanoA,PerezMorenoMA,etal.Thetranscriptionfactorsnailcontrolsepithelialmesenchymaltransitionsbyr
7、epressingEcadherinexpression[J].NatCellBiol,2000,2(2):7683?[2]ComijnJ,BerxG,VermassenP?MechanismsofinactivationofEcadherininbreastcarcinoma：modificationofthetwohithypothesisoftumorsuppressorgene[J].MolCell,2001,7(6):12671278.[3]BolosV,PEinadoH,PerezMorenoMA,etaLThet
