資源描述：
《Snail／GST融合蛋白的原核表達(dá)及其多克隆抗體制備（醫(yī)學(xué)論文）》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、Snail/GST融合蛋白的原核表達(dá)及其多克隆抗體制備作者：張儒英，云昆侖，喬惠珍，王冰晶，張志謙【關(guān)鍵詞】Snail;融合蛋白；多克隆抗體0引言上皮型鈣粘附素(Ecadherin,Ecad)介導(dǎo)的粘附系統(tǒng)的破壞，是腫瘤從非浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)化為浸潤(rùn)性的關(guān)鍵步驟［1］。而鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail,具有下調(diào)Ecad的作用［2］,本研究通過制備Snail抗體，為進(jìn)一步開展Ecad的功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1主要試劑和菌株主要試劑購(gòu)自北京中山公司；大腸桿菌DH5a和BL21由北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京市腫瘤防治研究所細(xì)Snail/GST融合蛋白的原核表達(dá)及其多克隆抗體制
2、備作者：張儒英，云昆侖，喬惠珍，王冰晶，張志謙【關(guān)鍵詞】Snail;融合蛋白；多克隆抗體0引言上皮型鈣粘附素(Ecadherin,Ecad)介導(dǎo)的粘附系統(tǒng)的破壞，是腫瘤從非浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)化為浸潤(rùn)性的關(guān)鍵步驟［1］。而鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail,具有下調(diào)Ecad的作用［2］,本研究通過制備Snail抗體，為進(jìn)一步開展Ecad的功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1主要試劑和菌株主要試劑購(gòu)自北京中山公司；大腸桿菌DH5a和BL21由北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京市腫瘤防治研究所細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存。1.2pGEX4T1/Snail原核表達(dá)載體的克隆從人血管內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA,在逆轉(zhuǎn)錄酶
3、作用下，合成cDNAo以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用上游引物5'CTGCAGGACTCTAATCCAG3'（含有EcoRI內(nèi)切酶位點(diǎn)）和下游弓幽5’ATCCTTGGCCTCAGAGAGC3’（含有Sall內(nèi)切酶位點(diǎn)）,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SnailC末端377bp的DNA片斷；酶切、瓊脂糖凝膠電泳分離后，用玻璃奶法（自制）純化回收，與pGEX4T1原核表達(dá)載體定向連接。轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，提取質(zhì)粒并酶切鑒定重組體。1.3融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化131表達(dá)鑒定表達(dá)質(zhì)粒Snail/pGEX4T1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后，經(jīng)過酶切鑒定，挑取陽(yáng)性細(xì)菌克隆至3mlLB/Amp+
4、試管中培養(yǎng)3?5h。SDSPAGE分析融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。1.3.2可溶性鑒定離心誘導(dǎo)菌液收集菌體,以PBS重懸（50MlPBS/lml菌液），加細(xì)菌裂解液混勻，冰浴。加入TritonX100至終濃度為1%,冰浴。冰上以20Hz間歇超聲裂解。再離心并分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDSPAGE,證實(shí)融合蛋白以包涵體形式存在。1.3.3純化加5倍體積超聲緩沖液懸浮沉淀，冰上間歇超聲30s,離心棄上清。重復(fù)3~4次。沉淀加等體積SDSPAGEloadingbuffer,超聲重懸，沸水煮5min后上樣，100V電泳6?7h。用冷0.1MKC1浸泡膠，切下目的條帶放入透析袋內(nèi)。
5、將透析袋置于水平電泳洗脫裝置內(nèi)，60V洗脫過夜，次日100V繼續(xù)洗脫lh,然后反轉(zhuǎn)電極向相反方向洗脫3?5mino吸岀透析帶內(nèi)液體，蔗糖包埋濃縮，PES透析。行SDSPAGE定量，即獲得純化的融合蛋白。1.4抗Snail多克隆抗體的制備抗原為原核表達(dá)并經(jīng)SDSPAGE膠純化的GST/Snail融合蛋白，免疫新西蘭白兔。取耳血，用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到10-5時(shí)，放血，收集血清。1.5抗體效價(jià)和特異性免疫學(xué)鑒定1.5.1酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)抗體滴度：觀察結(jié)果并用ELISAReader測(cè)OD490nmo1.5.2WesternElot鑒定抗體S
6、DSPAGE分析融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。2結(jié)果2.1Snail/pGEX4T1原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定結(jié)果以Snail全長(zhǎng)為模板，PCR大量擴(kuò)增出Snail片段，經(jīng)鑒定在約400bp處有條帶擴(kuò)出，與推算值相符；將目的片段裝入pGEX4T1原核表達(dá)載體后，酶切鑒定正確，在近4OObp處有條帶釋放。2.2融合蛋白GST/Snail的誘導(dǎo)表達(dá)和純化經(jīng)純化的GST/Snail融合蛋白只有一條蛋白帶。2.3Snail多克隆抗體活性鑒定2.3.1ELISA鑒定經(jīng)制備型SDSPAGE進(jìn)一步純化的融合蛋白GST/Snail免疫新西蘭兔獲得抗血清，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其效價(jià)為5xl
7、05o2.3.2WesternBlot鑒定抗體Snail/pGEX4T1感染的細(xì)胞在近40KD處出現(xiàn)條帶。3討論本課題通過基因工程手段原核表達(dá)Snail竣基端的GST融合蛋白[3],然后免疫新西蘭兔獲得效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗Snail抗體，與一些進(jìn)口抗體相比造價(jià)低，且適用于免疫熒光、石蠟切片等[4],為深入研究其功能和探討其與腫瘤等疾病的相關(guān)性提供了工具。我們利用該抗體研究了宮頸不同組織學(xué)階段的蠟塊標(biāo)本，Snail1表達(dá)的免疫組織化學(xué)反應(yīng)在宮頸癌中呈上升趨勢(shì)，陽(yáng)性表達(dá)率為81.9%,與正常及非典型增生組差別明顯(PV0.05),證明Snail與癌分化程
