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《重組人il11的原核表達(dá)、純化和鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文4．hrlL．11／His蛋白的生物學(xué)活性測(cè)定含10％新生牛血清和2ng／mLhlL6的RPMll640培養(yǎng)液培養(yǎng)IL．6依賴細(xì)胞株T1165，活性測(cè)定前用只含有10％新生牛血清的RPMll640培養(yǎng)液洗滌3次，以除去原培養(yǎng)基中的hlL6。調(diào)整細(xì)胞濃度為1-2×105／mL，接種到96孔平底培養(yǎng)板，每孔加100此，加入不同稀釋度IL．11待檢樣品，100此／孔，每份設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。設(shè)含ILll標(biāo)準(zhǔn)品的陽(yáng)性對(duì)照和不加IL．11的陰性對(duì)照。培養(yǎng)48～72h后，每孔加10此MTT，繼續(xù)培養(yǎng)“h，輕輕
2、吸出150皿上清，加入150此二甲亞砜(DMSO)，溶解10min后，570nM測(cè)定吸光度值。結(jié)果1．重組質(zhì)粒的構(gòu)建經(jīng)PCR擴(kuò)增的hrlL-11基因片段長(zhǎng)度為510bp，與預(yù)計(jì)大小相符。經(jīng)序列比對(duì)準(zhǔn)確無(wú)誤，無(wú)讀碼錯(cuò)誤。2．重組蛋白表達(dá)純化重組質(zhì)粒pET2la-hrlL一11轉(zhuǎn)化BL-21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白占菌體總蛋白的20％，主要以包涵體的形式存在，分子量19KD。在Ni．NTA親和層析中采用30--200mmol／L咪唑的梯度洗脫，最后hrlL．11蛋白的純度達(dá)到95％以上。3．
3、重組蛋白Westernblotting鑒定Westernblot結(jié)果證實(shí)，目的蛋白是帶有6His標(biāo)簽的IL．11重組蛋白。4．重組蛋白的生物學(xué)活性測(cè)定利用Tl165細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hrlL．11生物學(xué)活性，結(jié)果表明，純化蛋白的比活達(dá)lxl06IU／mg，與IL．11標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)。結(jié)論2溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文1．成功構(gòu)建了pET2la-hrIL一11高效表達(dá)質(zhì)粒2．成功制備了純度大于95％的hrIL．11蛋白3．獲得了具有IL．11生物學(xué)活性的hrIL．11蛋白關(guān)鍵詞重組人白細(xì)胞介素11；原核表達(dá)；純化；生物學(xué)活
4、性溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文ProkaryoticExpressionPurificationandIdentificationofRecombinantHumanIL．11ProteinObjectiveABSTRACTToconstructhumaninterleukin一11(hrlL-11)expressionvectorandexpress，purify,refoldhrlL-11protein，andinvestigateitsbiologicalactivity．MethodsI．Constructio
5、nofhrlL-11expressingplasmidTheDNAencodinghrlL一11wasrequiredbyPCRandinsertedintothevectorpET21a(+)．ThehrlL·11proteinwasdesignedtocontainsingle6xHistagatitsC-terminalforpurification．TheexpressionplasmidwasverifiedbyDNAsequencingfrombothdirectionswimT7promoteran
6、dT7terminatorprimers．2．ExpressionandpurificationofhrlL一11proteinE．colicellstransformedwithPET21a(+)containingbaiL一11insertweregrownin500mLLuriabrothmediumwithampicillinat37℃．WhenOD600oftheculturereached0．4．0．6．1mmol／LIPTGWasaddedtoinducebacterialcellstoproduc
7、ehrlL．11protein．Afterincubatedat37℃for4hours，thecellswereharvestedbycentrifI．tgationat10，0009for5minutes．nlepelletWassuspendedin30mLofcelllysisbufferandthendisruptedbysonication．Afterwashing，thepelletswereresuspendedanddissolvedincolumnbuffer,filteredby0．22肛m
8、membraneandpurifiedbyaffinitychromatographyontheNi-NTAcolumn．3．RefoldingofhrlL-11proteinandWesternblottingThepurifiedproteinwasadjustedto50---100Itg／mLandrefoldedbydialysisagainst20volbuf
