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1、分類號(hào)S852學(xué)校代碼10129UDC57.083.3學(xué)號(hào)2009201047非洲豬瘟病毒VP73蛋白的原核表達(dá)純化及單克隆抗體的制備與鑒定ProkaryoticExpressionandPurificationofProteinVP73inAfricanSwineFeverVirus,andPreparationandIdentificationofMonoclonalAntibodies申請(qǐng)人：陳軼學(xué)科門類：農(nóng)學(xué)學(xué)科專業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究方向：獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)指導(dǎo)教師：曹金山教授吳曉東副研究員論文提交日期：二〇一二年五月摘要非洲豬瘟（Africanswinef
2、ever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）感染豬引起的急性、熱性、烈性、高度接觸性傳染病，二十世紀(jì)中期以來，已在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個(gè)國家流行，并在近幾年內(nèi)蔓延至歐亞接壤的格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆以及俄羅斯境內(nèi)，一旦侵入我國，危害極大。VP73蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由B646L基因編碼，分子量約為73ku。VP73是病毒粒子二十面體衣殼的重要組成部分，產(chǎn)生于病毒感染的晚期，約占整個(gè)病毒粒子蛋白的32%。VP73蛋白作用主要體現(xiàn)在非洲豬瘟病毒結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞過程中和病毒粒子衣殼的產(chǎn)生兩方面。大多數(shù)非
3、洲豬瘟病毒毒株都有很強(qiáng)的毒力以及相反地很低的免疫原性。有研究表明，各地區(qū)的毒株產(chǎn)生的VP73抗體相應(yīng)抗原表位都很保守，VP73蛋白具有穩(wěn)定的抗原性，是血清學(xué)檢測和免疫制劑常用蛋白。VP73參與了病毒的吸附過程，針對(duì)VP73的抗體可以阻斷病毒與巨噬細(xì)胞的結(jié)合。此外VP73還參與了病毒裝配過程中pp220和pp62的加工?；诖吮尘?，本論文根據(jù)已發(fā)表的非洲豬瘟病毒VP73基因核酸序列的主要抗原表位區(qū)，自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以陽性質(zhì)粒pMD18T-VP73為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了612bp大小的核酸片段，將其克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)，構(gòu)建原核表達(dá)
4、載體pET32a-vp73。鑒定正確的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21（DE3），挑取陽性克隆菌落培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)后裂解菌體作12%SDS-PAGE蛋白電泳分析，出現(xiàn)大小約43ku的融合蛋白條帶。融合蛋白純化后經(jīng)Westernblot分析，表明該蛋白具有較好的免疫原性。通過摸索表達(dá)條件，優(yōu)化了重組VP73蛋白的表達(dá)：用含100mM氨芐的LB液體培養(yǎng)基37℃振搖培養(yǎng)，待菌生長至0D值為0.6時(shí)，用終濃度為0.8mM的IPTG誘導(dǎo)，于37℃振蕩培養(yǎng)5h。對(duì)離心收集后的菌體上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析表明，融合蛋白以包涵體的形式存在，經(jīng)超聲波裂解菌體
5、后，分離包涵體并離心、洗滌，再用6M尿素溶解包涵體，最后用試劑盒純化融合蛋白。以原核表達(dá)并純化的非洲豬瘟病毒VP73蛋白為免疫原，按常規(guī)方法免疫BALB/c小鼠，細(xì)胞融合前建立了間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株的最佳反應(yīng)條件。即：抗原包被濃度為2μg/mL，以1:1000稀釋的陰、陽性血清分別作為陰、陽性對(duì)照，反應(yīng)條件均為37℃1h。取免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，陽性孔經(jīng)三次有限稀釋法克隆，最終獲得一株持續(xù)且穩(wěn)定分泌抗VP73蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1C8。對(duì)該株雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性、亞類、腹水效價(jià)、特異性
6、和生物學(xué)活性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，所獲得的單克隆抗體穩(wěn)定性好；經(jīng)亞類鑒定，該株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗5體類型為lgGI亞類；其腹水效價(jià)達(dá)到1.024×10以上；該株單抗特異性針對(duì)目的蛋白而非針對(duì)組氨酸標(biāo)簽蛋白，且與其他病毒的蛋白無交叉反應(yīng)，特異性較好。關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒；VP73蛋白；原核表達(dá)；單克隆抗體；ProkaryoticExpressionandPurificationofProteinVP73inAfricanSwineFeverVirus,andPreparationandIdentificationofMonoclonalAntibodiesAbstr
7、actAfricanswinefever(ASF)isahighlycontagiousandfatalhemorrhagicviraldiseaseofdomesticpigs,andcausedbyAfricanswinefevervirus(ASFV).Sincethemid-twentiethcentury,ASFhasbeendisseminatedindozensofcountriesinAfrica,EuropeandAmerica,andinrecentyearsitspreadtoGeorgia,Armenia,AzerbaijanandRuss
8、ia.On
