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《非洲豬瘟病毒p30重組蛋白的表達(dá)及單克隆抗體制備》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、揚9、H大學(xué)碩士學(xué)位論文非洲豬瘟病毒p30重組蛋白的表達(dá)及單克隆抗體制備碩士研究生：儲德文導(dǎo)師：孫懷昌教授中文摘要非洲豬瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(Africanswinefevervires．ASFV)引起的一種高度致死性傳染病，強毒株感染的死亡率高達(dá)100％。該病一直在許多非洲國家流行，近年來流行范圍有擴大趨勢，已傳播到格魯齊亞、俄羅斯等鄰國，使我國養(yǎng)豬業(yè)面臨巨大威脅。ASFV能以軟蜱和非洲野豬作為儲存宿主和傳播媒介，具有復(fù)雜的感染與免疫逃避機制，目前無任何疫苗用于防疫，因此快速、準(zhǔn)確的診斷對防止該病
2、傳入和控制具有重要意義。p30是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白和強免疫原性蛋白之一，重組p30是非常重要的ASFV診斷抗原。為了制備p30重組抗原和單克隆抗體用于ASFV診斷，本研究將E75株ASFVp30基因序列優(yōu)化成大腸桿菌密碼子偏愛序列，將人工合成的序列插入原核表達(dá)載體pET-30a，用重組載體pET-P30轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，SDS．PAGE分析結(jié)果顯示：表達(dá)的His．p30融合蛋白為預(yù)期的30kD，主要以包涵體形式表達(dá)。用鎳柱親和層析法從重組菌裂解物純化得高純度的His．p30融合蛋白，以純化蛋白為抗原免疫小
3、鼠，每次免疫后采血分離血清。以重組蛋白為包被抗原，用方陣試驗確定最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)，用建立的間接ELISA對免疫小鼠血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示4次免疫小鼠血清的抗體效價為1：1638400；按照常規(guī)的雜交瘤制備方法，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞融合，用ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞陽性克隆，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，經(jīng)過三次亞克隆后獲得兩株穩(wěn)定分泌p30單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；以重組p30為抗原，用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行間接免疫熒光和Westernblot檢測，結(jié)果顯示分泌的單克隆抗體能與p30特異反應(yīng)；用2株雜交瘤細(xì)胞注射小
4、鼠，收集腹水進(jìn)行抗體效價測定，結(jié)果顯示3H7A7和6D10G7株雜交瘤腹水單抗的ELISA效價分別為215和217。關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒；p30蛋白；原核表達(dá)；單克隆抗體制備儲德文：非洲豬瘟病毒p30重組蛋白的表達(dá)及單克隆抗體制備2ExpressionandMonoclonalAntibodyPreparationofthep30RecombinantProteinofAfricanSwineFeverVirusM．S．Candidate：ChuDewenSupervisor：Prof．SunHuaichangAbstractAfficans
5、winefever(ASF)isahighlylethaldiseaseinpigscausedbyA銜canswinefevervirus(ASFV)．ThemortalityofthevirulentstraininfectionCallbe100％．ThediseasehasbeingprevalentinmanyA銜cancountriesandhastransmittedrecentlytoourneighboringcountriesincludingGeorgiaandRussia，whichposesagreatthreatt
6、oswineindustryinChina．ASFVCanuseA餓canwildpigsandsoftticksasthevirusrepertoireandtransmissionvectors、析thhighlycomplicatedinfectionandimmuneevasionmechanisms．Precently,novaccineisavailableandthusquickaccuratediagnosisisveryimportantforpreventionoftransmissionandcontrolofthedi
7、sease．P30isoneofthemajorstructuralandhighlyimmunogenicproteinofASFV,whichhasbeenusedastheantigenfordiagnosisofthevirus．Inthisstudy,weoptimizedthep30genesequenceofE75strainASFVforE．coliexpressionandclonedthesyntheticsequenceintoprokaryoticexpressionvectorpET-30a．Therecombina
8、ntvectorpET-P30wastransformedintoBL21(DE3)E．coliandexpressionoftheHis-p30fusionpro
