抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白單克隆抗體的制備.pdf

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1、動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(12)：64—67ProgressinVeterinaryMedicine抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白單克隆抗體的制備陳軼，吳曉東，鄒艷麗，趙金山，包靜月，曹金山，王志亮(1．中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266114；2．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)摘要：為了制備抗非洲豬瘟病毒(ASFV)VP73蛋白的單克隆抗體(MAb)，原核表達(dá)并純化了該病毒的重組VP73蛋白，按常規(guī)方法免疫Balb／c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞融合，對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，陽性孔經(jīng)3次有

2、限稀釋法亞克隆，最終獲得了一株穩(wěn)定分泌抗ASFVVP73蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1C8。EIISA檢測和Westernblot分析表明，所獲得的MAb與重組VP73蛋白呈陽性反應(yīng)，腹水效價為1．024×10，該MAb的抗體類型為IgG1亞類。關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒；VP73蛋白；單克隆抗體中圖分類號：$852．43；$852．65l文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007—5038(2012)12-0064—04非洲豬瘟(Africanswinefever，ASF)是一種由倩等口對非洲豬瘟病毒VP73蛋白的B細(xì)胞表位非洲豬瘟病毒(

3、Africanswinefevervirus，ASFV)感進(jìn)行了預(yù)測。本研究在對ASFVVP73蛋白主要抗染引起的豬的急性、烈性、高度接觸性傳染病口]。原表位區(qū)原核表達(dá)的基礎(chǔ)上，制備了相應(yīng)的單克隆ASFV是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟抗體。病毒屬(Asfivirus)惟一成員_2]，為具有囊膜的雙股1材料與方法DNA病毒，蜱類是其主要自然宿主和傳播媒介[3]。1．1材料ASFV感染豬后以高熱、食欲廢絕、皮膚和內(nèi)臟器官1．1．1菌種、質(zhì)粒、動物和細(xì)胞宿主菌E．coli出血為臨床特征，病死率極高]。因此，ASF

4、是世界BL21(DE3)為Invitrogen公司產(chǎn)品；重組質(zhì)粒動物衛(wèi)生組織(OIE)要求法定報告的動物疫病，也pET32a—vp73、非洲豬瘟病毒陽性血清、Balb／c小鼠是《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定的一類動物疫及小鼠骨髓瘤細(xì)胞株(SP2／O)均由中國動物衛(wèi)生與病。流行病學(xué)中心保存。ASFV整個基因組含有160個～175個開放閱1．1．2試劑非預(yù)染蛋白Marker和預(yù)染蛋白讀框(()RF)，編碼150種～200種蛋白質(zhì)]。根據(jù)Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；HisBindPurifica—Pubmed中所列西班

5、牙BA71V分離株全基因序列tionKit為Novagen公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑顯示，ASFV基因組含有151個主要閱讀框，編碼數(shù)盒為Biomiga公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全量眾多的蛋白]。VP73蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)佐劑、PEG和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠蛋白，由B646L基因編碼，全蛋白分子質(zhì)量約為73和羊抗豬IgG均為Sigma公司產(chǎn)品；HT、HAT和ku_8一。VP73蛋白是病毒粒子20面體衣殼的重要組DMEM均為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清為成部分，產(chǎn)生于病毒感染的晚期，約占整個病

6、毒粒子蛋白的32E93。VP73蛋白在ASFV結(jié)合和進(jìn)入易ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品。其他試劑均為感細(xì)胞過程中有很重要的作用¨1，并對病毒粒子衣國產(chǎn)分析純。殼的產(chǎn)生起至關(guān)重要的作用[1。ASFV大多數(shù)分1．2方法離株的毒力都很強(qiáng)，但是免疫原性很低，只有少數(shù)幾1．2．1免疫原的制備個蛋白具有免疫原性。有研究表明，不同區(qū)域AS—l_2．1．1重組質(zhì)粒的鑒定和表達(dá)用BamHI和FV分離株誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗VP73蛋白抗體的相應(yīng)抗XhoI雙酶切重組質(zhì)粒pET32a—vp73，將酶切產(chǎn)物原表位都相當(dāng)保守l1。VP73蛋

7、白的免疫原性很穩(wěn)進(jìn)行30g／L瓊脂糖凝膠電泳。將重組質(zhì)粒定¨]，可以被用來作為血清學(xué)檢測和免疫制劑。李pET32a—vp73委托寶生物工程(大連)有限公司測收稿日期：2012—05—10基金項(xiàng)目：國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(200903037)作者簡介：陳軼(1986一)，男，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，主要從事豬瘟病毒研究。*通訊作者陳軼等：抗非洲豬瘟病毒VP73蛋白單克隆抗體的制備65序。將空質(zhì)粒pET32a(+)和重組質(zhì)粒pET32a—用MAb亞類鑒定試劑盒對MAb的亞類進(jìn)行鑒定。vp73分別轉(zhuǎn)化至E．coliBL2

8、1(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。單抗腹水作倍比稀釋，采用間接ELISA測定單抗腹將重組菌接種至含氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)水的效價?；?，37℃振搖至OD600nm值約為0．6，加入終濃2結(jié)果度為0．8mmol／L的IPTG，誘導(dǎo)4．5h，菌體裂解2．1重組質(zhì)粒酶切