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《蛋白原核表達(dá)與純化-(新生培訓(xùn)）》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、蛋白的原核表達(dá)與純化策略ZHEJIANGUNIVERSITYChengCY2012-11-10PartⅠ蛋白的原核表達(dá)PartⅡ蛋白純化PartⅠ蛋白的原核表達(dá)1原核表達(dá)概述2原核表達(dá)策略選擇3表達(dá)結(jié)果檢測(cè)4常見問題與實(shí)驗(yàn)例大腸桿菌(Escherichiacoli)最通用的原核表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達(dá)載體種類齊全，表達(dá)效率高；基本不分泌，易形成包涵體(缺乏正確折疊的蛋白結(jié)構(gòu))，無蛋白加工等修飾；常見的原核表達(dá)載體：pET系列(T7promoter，Novagen公司)；pQE系列(T5promoter，Qiag
2、en公司)；pGEX系列(GST融合表達(dá)，GE公司)；pBAD系列(Arabinose誘導(dǎo)型)目的基因擴(kuò)增目的基因插入表達(dá)載體重組基因轉(zhuǎn)化入宿主菌中外源基因的表達(dá)外源基因在大腸桿菌中表達(dá)流程“基因——載體——菌株——培養(yǎng)”系統(tǒng)名稱公司啟動(dòng)子抗性常用標(biāo)簽特點(diǎn)pGEXGEtacAmpGST·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，谷胱甘肽一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，麥芽糖一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck (Novag
3、en)T7 T7lacAmp KanHis·Tag種類豐富。標(biāo)簽小，無需切割，一般來說，對(duì)蛋白活性無影響。純化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系統(tǒng)常用原核表達(dá)載體系統(tǒng)pET表達(dá)載體系統(tǒng)pET系統(tǒng)最初由Studier及其同事構(gòu)建(StudierandMoffatt,1986)，是有史以來在E.coli中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)；目的基因被克隆到pET質(zhì)粒上，受噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制；表達(dá)有宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7RNA聚合酶機(jī)制十分有效并具有選擇性：充分誘導(dǎo)時(shí)，幾
4、乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)，目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋白的50%以上。pET各種表達(dá)載體特性T7lac啟動(dòng)子:表達(dá)更加嚴(yán)謹(jǐn)T7啟動(dòng)子融合標(biāo)簽常用于蛋白檢測(cè)與純化。有時(shí)也可增加蛋白可溶性、將蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)至特定位置?？紤]因素細(xì)胞特性蛋白穩(wěn)定性蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶多種常用表達(dá)菌株均為此類，如BL21、Origami、Rosetta等啟動(dòng)子tac啟動(dòng)子需要大腸桿菌自身的RNA聚合酶即可：BL21 T7啟動(dòng)子需要能夠提供T7RNA聚合酶的細(xì)胞：DE3溶源菌抗性細(xì)胞不能與載體帶有相同的抗性
5、：pET-28a+OrigamiB(DE3)No！pET-21b+OrigamiB(DE3)Yes！嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控BL21(DE3)pLysS/BL21(DE3)pLysE稀有密碼子Rosetta系列溶解性O(shè)rigami系列：Origami，OrigamiB和Rosetta-gami稀有密碼子：不同生物使用密碼子存在偏愛性。某種或某幾種tRNA的缺乏，會(huì)導(dǎo)致外源目的基因的mRNA無法正常在E.coli里表達(dá)，是為“稀有”密碼子。表達(dá)菌株的選擇表達(dá)條件的優(yōu)化常用表達(dá)條件的優(yōu)化培養(yǎng)基組分：葡萄糖會(huì)抑制cAMP形成，進(jìn)而抑制表達(dá)，嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，無其他嚴(yán)
6、謹(jǐn)調(diào)控手段（pLysS）且毒基因時(shí)，至關(guān)重要溫度：影響表達(dá)速率、蛋白可溶性與活性IPTG：濃度影響表達(dá)速率、蛋白可溶性與活性其他因素：培養(yǎng)基體積與通氣37℃搖床培養(yǎng)到OD600=0.4-0.1（建議OD600為0.6）約3-4小時(shí)可達(dá)到；從中取出一些樣品作為未誘導(dǎo)對(duì)照，在剩下的樣品中加入IPTG至終濃度0.4（T7啟動(dòng)子）或1mM（T7lac啟動(dòng)子），繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時(shí)；菌體5000g，4℃離心。如果需要，收集上清進(jìn)行進(jìn)一步分析；重懸細(xì)胞于1/10體積預(yù)冷的20mMTris-HCl或50mMPBS（pH8.0）中離心；除去上清，菌體保存
7、于-70℃冰箱或繼續(xù)純化。常規(guī)的誘導(dǎo)條件表達(dá)策略的選擇實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋磉_(dá)策略活性分析可溶表達(dá)制備抗原包涵體高純度融合標(biāo)簽結(jié)構(gòu)研究天然蛋白…………根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇表達(dá)策略選擇表達(dá)載體選擇表達(dá)菌優(yōu)化表達(dá)條件選擇表達(dá)載體系統(tǒng)名稱公司啟動(dòng)子抗性常用標(biāo)簽特點(diǎn)pGEXGE (Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，谷胱甘肽一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，麥芽糖一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck (
8、Novagen)T7 T7lacAmp KanHis·Tag種類豐富。標(biāo)簽小，無需切割，一般來說，對(duì)蛋白活性無影響。純化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系統(tǒng)選擇表達(dá)
