原核表達及純化方法

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原核表達及純化-Histag一、原核表達1.挑取一個單菌落（重組表達載體），接種到10mLLB培養(yǎng)基中（注意抗生素抗性）。37℃，過夜搖菌。2.次日，將菌液接種到1LLB培養(yǎng)基中（1:50~1:100），繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.6時（0.6~0.8），加1×IPTG誘導4h。（加IPTG前留樣（誘導前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL誘導后全菌；(2)小量表達：收集5mL誘導后全菌，12000g離心1min，裂解沉淀，分別收集上清（可溶性）和沉淀（包涵體）中的蛋白。大量表達：收集1L誘導后全菌，4℃，4500g離心15~30min。二、可溶性分析目的：重組蛋白是否表達，是可溶性的還是包涵體形式。根據(jù)這個結(jié)果選擇純化方法。（1）各用30μL4×SDSLoadingbuffer重懸誘導前和誘導后的菌體（200μL）；用500μL1×BindingBuffer重懸菌體（5mL），超聲破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g離心15min，分離上清和沉淀；（2）用30μL4×SDSLoadingbuffer重懸沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL4×SDSLoadingbuffer；（4）將誘導前全菌，誘導后全菌，上清蛋白和包涵體蛋白煮沸5~10min。（5）各取10μL用于SDS-PAGE檢測（12%的膠）。三、小量富集實驗樣品制備：7 取5mL誘導全菌，用500μL1×BindingBuffer（8MUrea）溶解，超聲破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。4℃，19000g離心15min，取上清用于富集實驗。（留樣做SDS-PAGE）富集：1.裝柱：取30μL~50μL體積的Ni柱料（純柱料）于1.5mL離心管中。2.平衡：向離心管中加200μL1×BindingBuffer（8MUrea），混勻1min，700g離心1min，去上清；重復一次。3.上樣：將制備的上清蛋白加到離心管中，混勻30min（混勻儀上）。700g離心1min，上清即為穿透（留樣做SDS-PAGE）。4.淋洗：加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，5mM咪唑），混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，10mM咪唑），混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，20mM咪唑），混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；5.洗脫：加50μL1×ElutionBuffer（8MUrea，50mM咪唑），混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；加50μL1×BindingBuffer（8MUrea，3000mM咪唑），混勻，700g離心1min，分離上清，留樣做SDS-PAGE；6.取少量柱料做SDS-PAGE；注：用定量工作液估計蛋白的濃度：2μL待測蛋白溶液+180μL定量工作液，根據(jù)顏色的變化可以估計蛋白的濃度。對富集過程進行監(jiān)控。一、大量富集實驗樣品制備：用50mL1×BindingBuffer（8MUrea）溶解菌體，超聲破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）或者用高壓破碎儀（推薦）。4℃，19000g離心15min，取上清用于富集實驗。（留樣做SDS-PAGE）富集：1.裝柱：將1mLNi柱料裝入層析柱，7 用至少三個柱體積的超純水以工作流速（每滴/3S）壓實柱料，以獲得均一的柱床，同時避免帶入氣泡。注：以下的層析操作流速不要超過裝柱流速的1.75倍。1.柱平衡：三個柱體積的1×BindingBuffer（8MUrea）平衡柱料。注：柱子掛上鎳離子后，可在Binging溶液中過夜，4℃。2.上樣：視樣品的多少可選用LOOP或由泵直接上樣兩種方式，接穿透峰以備SDS-PAGE檢測。3.淋洗：去除非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，接穿透峰以備SDS-PAGE檢測。10個柱體積的1×BindingBuffer（8MUrea）；6個柱體積的WASHBuffer（分別是含有10mM咪唑，20mM咪唑的1×BindingBuffer（8MUrea））；注：也可以根據(jù)定量工作液錯落估計蛋白的濃度，以確定每步的淋洗是否完全。4.洗脫：6個柱體積的1×BindingBuffer（8MUrea，50mM咪唑）；6個柱體積的1×BindingBuffer（8MUrea，100mM咪唑）；6個柱體積的1×BindingBuffer（8MUrea，300mM咪唑）；留樣做SDS-PAGE；注：也可以不使用含100mM咪唑的洗脫液；至于每步用多少體積的洗脫液，可根據(jù)粗略定量而定；最好每管收集0.5mL富集的蛋白。一、SDS-PAGE檢測：可溶性分析：Marker誘導前全菌空誘導后全菌空可溶性蛋白空包涵體蛋白空空純化檢測：Marker純化前穿透10mM咪唑20mM咪唑50mM咪唑100mM咪唑300mM咪唑注：每個咪唑濃度均可以Loading7 多個樣品，如果一塊膠不夠的的話可以考用用多個。一、Bradford定量根據(jù)蛋白的濃度和純度，將相近的合并到一起。采用Bradford定量。1.啟動VersaMicroplateReader,預熱5-10分鐘；2.在Eppendorf離心管中制備一系列濃度的BSA標準蛋白，較適的濃度范圍為，0.1-1mg/ml，7到8個濃度；可配置5mg/ml的儲液，用時稀釋到0.2mg/ml。3．加入20ml標準蛋白至微板孔中，以水或相應(yīng)的緩沖液為空白對照；4．加入20ml樣品液，如果樣品蛋白濃度較高，可考慮用樣品緩沖液稀釋，但是加入微板孔中的樣品體積必須維持在20ml；5.加入180ml的過濾的Bradford定量工作液；1234567891011樣品BSA0.2μg/μL00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0-012345678910-ddH2OμL1817161514131211109818Buffer(或樣品)μL222222222222Bradford1801801801801801801801801801801801806.將微板置于VersaMicroplateReader；7.選擇自動混合功能，震動一分鐘；8.室溫下靜止5分鐘；9．選擇光吸收波長為595nm；10．按“Read”鍵,讀取數(shù)據(jù)；11．輸出數(shù)據(jù)，計算定量結(jié)果。7 注：1．該機器所讀出的數(shù)據(jù)可通過及其自身的軟件進行處理（請參見軟件的說明），也可以直接paste數(shù)據(jù)至Excel中，再行處理；2．所配的標準蛋白也必須充分考慮到樣品制備液對Bradford試劑的干擾。一般說來，標準蛋白儲液可以樣品制備液來稀釋；3.所測的樣品，無論是標準蛋白質(zhì)還是樣本，都必須平行測定至少兩次。4.配置上述反應(yīng)體系時，一定要認真細心，要盡量減小平行微孔的差別。七、溶液配制1、8×Binding溶液40mM咪唑4MNaCl160mMTris-HClpH7.92、4×Elute溶液4M咪唑2MNaCl80mMTris-HClPh7.93、8×charge溶液4、8×Wash溶液160mM咪唑4MNaCl160mMTris-HClpH7.95、4×strip溶液40mMEDTA2MNaCl80mMTris-HCl7 Ph7.9注：（1）如樣品在變性狀態(tài)下，則應(yīng)在Binding，Elute，Wash溶液中加入4~8M的尿素。（2）PH的調(diào)節(jié)應(yīng)在加完尿素和稀釋完儲液后調(diào)節(jié)。一、注意事項：（1）層析具體操作中各緩沖溶液的注入量以PH及電導基線基本不再變化為止。（2）所有的樣品和溶液層析前，應(yīng)脫氣和過膜（0.45μm）。（3）當柱流速明顯減低或?qū)游鼋橘|(zhì)被charge后不再變藍時，需再生柱子。再生的方法：依次將以下的溶液按建議的體積數(shù)處理介質(zhì)。兩個柱體積的8Ｍ的尿素，兩個柱體積的水，一個柱體積的２％?。樱模?，一個柱體積25%的乙醇，一個柱體積50%的乙醇，一個柱體積75%乙醇，一個柱體積100%乙醇，一個柱體積75%乙醇，一個柱體積50%乙醇，一個柱體積25%乙醇，一個柱體積水，五個柱體積100mM的ＥＤＴＡ(PH=8.0)，三個柱體積水，三個柱體積20%的乙醇，儲存于4℃。（4）加變性劑的Binding溶液應(yīng)在平衡的最后步驟中使用，故應(yīng)配兩組Binding溶液，即8×且不含尿素和1×含尿素。（5）ＤＴＴ，ＢＭＥ，ＥＤＴＡ應(yīng)避免在層析溶液中，因為ＤＴＴ，ＢＭＥ會與鎳離子形成棕色沉淀，而ＥＤＴＡ會剝離鎳離子。（6）為減少樣品的粘度，可用Dnase處理（不用超聲時），方法如下：在樣品液中加入終濃度為10mMMgSO4，20μg／mlDnase室溫放置20分。但此種處理方法會增加樣品被蛋白酶水解的危險。（7）加入蛋白酶抑制0.2Ｍ的乙醇溶液，－20℃儲藏。工作濃度為儲液稀釋200倍。（ＰＭＳＦ在水溶液中的半衰期短）。（8）Ｗash溶液的咪唑需調(diào)節(jié)，與組氨酸的長度有關(guān)。如六個組氨酸所需的淋洗濃度低于十個組氨酸所需的淋洗濃度。7 （9）變性蛋白質(zhì)的一般復性方法。Ａ、透析既逐步降低變性劑的濃度；Ｂ、稀釋法（10）可將變性劑直接加入到Binding，Washing,Elute溶液中，但需在加入變性劑后調(diào)節(jié)PH至所需的值。7