重組人胸腺素β4基因的克隆、表達(dá)、純化、鑒定及活性檢測

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1、重組人胸腺素β4基因的克隆、表達(dá)、純化、鑒定及活性檢測【摘要】目的:利用基因工程的方法原核表達(dá)重組人胸腺素β4(Tβ4)并對其進(jìn)行純化和鑒定.方法:使用大腸桿菌偏愛密碼子合成人Tβ4全長基因,構(gòu)建了Tβ4的二串聯(lián)體基因(Tβ4②),將其克隆入表達(dá)載體pET22b(+)中,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)鹽析、疏水層析和離子交換層析純化重組蛋白,采用免疫印跡和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對重組蛋白進(jìn)行鑒定.結(jié)果:獲得了純化的重組Tβ4②蛋白,并具有生物學(xué)活性.結(jié)論:成功構(gòu)建、表達(dá)和純化了Tβ4②,為

2、其功能研究奠定基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】胸腺素β4串聯(lián)重復(fù)序列克隆分子基因表達(dá)0引言胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)廣泛分布于各組織、器官和細(xì)胞中,與免疫功能、神經(jīng)發(fā)育和肌動蛋白功能密切,還可抗炎,促進(jìn)血管生成［1］、創(chuàng)傷愈合［2］、毛囊發(fā)育［3］,修復(fù)受損的心肌［4］.雖然Tβ4有著廣泛的應(yīng)用前景,但由于其分子太小，難于直接在大腸桿菌中表達(dá).目前用于實(shí)驗(yàn)室及臨床試驗(yàn)的Tβ4主要為化學(xué)合成品,價(jià)格昂貴,使其應(yīng)用受到限制.我們利用基因合成與PCR技術(shù),構(gòu)建了Tβ4的二串聯(lián)體基因（Tβ4②）表達(dá)載體,在大腸桿菌中成功地表達(dá)和純化了該串聯(lián)

3、體,為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料質(zhì)粒pET22b(+)，大腸桿菌DH5α及BL21(DE3)由本中心保存;人Tβ4全長基因、測序(北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司);引物(上海英峻生物公司);限制性內(nèi)切酶NdeⅠ,BamHⅠ,SalⅠ,T4DNA連接酶以及DNAMarkerDL2000(TaKaRa);TaqPCRMix(天根生化科技有限公司);B型質(zhì)粒小量提取試劑盒,小分子量DNA片段高效快速回收試劑盒(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司);蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas);兔抗人Tβ4多克隆抗體(Abcam,

4、ab14334);HRP山羊抗兔IgG,DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);IPTG,瓊脂,瓊脂糖,MTT(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司);PhenylSepharose6FastFloacia);ConA(華美生物工程公司),小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),RPMI1640(Gibco),Tβ4化學(xué)合成品(ProSpecTany),其他試劑均為國產(chǎn)分析純;BALB/c小鼠,雄性,6~8周齡(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心).1.2方法1.2.1重組Tβ4②基因的

5、克隆按照大腸桿菌慣用密碼子及人胸腺素β4氨基酸序列設(shè)計(jì)并合成了編碼Tβ4的全基因片段,5′和3′末端分別帶有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn),將其克隆入pET22b(+)中,NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定后,將其命名為pET22b(+)Tβ4①;合成兩條引物,上游引入BamHⅠ酶切位點(diǎn),下游引入SalⅠ酶切位點(diǎn)及終止密碼子TAG,以pET22b(+)Tβ4①為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后克隆入pET22b(+)Tβ4①中,BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定并測序,命名為pET22b(+)Tβ4②.

6、1.2.2重組Tβ4②的表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b(+)Tβ4②轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性克隆接種于含氨芐青霉素100mg/L的LB培養(yǎng)液中,37℃震蕩培養(yǎng)過夜,(a)以1∶100分別轉(zhuǎn)接入六個(gè)試管中,繼續(xù)培養(yǎng)2h(A600nm=0.5)后,其中一管作為誘導(dǎo)的陰性對照,另五管分別加入終濃度為0.01,0.05,0.1,0.5,1mmol/LIPTG,繼續(xù)培養(yǎng)4h,離心收集菌體行SDSPAGE;(b)以1∶100分別轉(zhuǎn)接入兩個(gè)試管中,繼續(xù)培養(yǎng)2h(A600nm=0.5)后,其中一管作為誘導(dǎo)的陰性對照,另一管加入終

7、濃度為0.01mmol/LIPTG,每隔1h收集菌體進(jìn)行SDSPAGE.1.2.3重組Tβ4②的I1640調(diào)整細(xì)胞濃度,加入ConA使其終濃度為2.5mg/L,按每孔4×105細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,37℃孵箱培養(yǎng)6h后,加入重組Tβ4②和Tβ4化學(xué)合成品,終濃度分別為2,4,8μmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)72h,MTT法測定淋巴細(xì)胞的增殖和分化.2結(jié)果2.1PCR及酶切和序列鑒定人Tβ4基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.2g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,在約135bp處可見特異性條帶(圖1),該片段大小與預(yù)測結(jié)果一致.分別用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和SalⅠ

8、,NdeⅠ和BamHⅠ,BamHⅠ和SalⅠ雙酶切pET22b(+)Tβ4②,在270bp處可見重組Tβ4②基因及135bp處的Tβ4基因片段(圖2).測序結(jié)果為序列正確的重組Tβ4②基因