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《重組胸腺素α1 的克隆、表達與純化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、重組胸腺素α1的克隆、表達與純化 關鍵詞:胸腺素α1;串聯(lián)體;克隆;基因表達;融合蛋白 摘要:目的利用基因工程方法表達胸腺素α1（thymosinalpha1，Tα1）的串聯(lián)體并進行純化、鑒定.方法將Tα1的基因拆分為4個片段進行合成，退火后經(jīng)PCR獲得串聯(lián)體基因，測序正確后克隆在硫氧還蛋白（thioredoxin）融合蛋白表達載體pThioHisA中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株，IPTG誘導表達，表達的融合蛋白經(jīng)過80℃熱處理及陰離子交換柱Q-SepharoseFastFloosinα1;tandemrepeat;cloning;geneex-pression;fusionpro
2、teins Abstract:AIMToexpresstandemrepeatofthymosinalpha1（Tα1）ethodandtopurifyandiden-tifythefusionprotein.METHODSSplitTα1geneintofourfragments，synthesizethemrespectivelyandgetthetandemrepeatgeneofTα1byannealingandPCR.Aftersequencingtoidentifyitscorrectness，clonethegeneintofusionexpres-sionvector
3、pThioHisA，transformstheE.colistrainTOP10idandinducesentandQSepharoseFastFloatographyandi-dentifiedbyolecularethodofexpressingtandemrepeatgeneispractical.ThesuccessfulexpressionofTα1③hasestablishedafoundationforitsbiologicalactivityresearch. 0引言 1966年Goldstein等［1］首次報道了從小牛胸腺中提取的初步具有生物活性的激素樣物質(zhì)，命名
4、為胸腺素.隨后的研究表明，它是由動物胸腺上皮細胞分泌的一類多肽和蛋白質(zhì)激素的總稱.胸腺素α1（thy-mosinalpha1，Tα1）是從胸腺素組分5（TF5）中分離純化出的熱穩(wěn)定酸性多肽［2］，由28個氨基酸組成，pI值為4.2，相對分子質(zhì)量為3108.它是一種具有多種生物學活性的免疫調(diào)節(jié)劑，已應用于治療乙肝、丙肝、癌癥［3］和免疫缺陷的研究中.雖然Tα1有著廣泛的應用前景，但由于其編碼的多肽過短，很難利用基因工程方法實現(xiàn)直接表達，所以目前商用的多是化學合成產(chǎn)品，價格較貴，使其臨床應用受到限制.為了探索Tα1多聚體的可能的生物學活性及其基因的體外表達，我們利用隨機退火與PCR技術相結(jié)
5、合的方法構(gòu)建了Tα1的多串體基因，在大腸桿菌中成功地誘導了表達，純化后獲得了Tα1③融合蛋白，從而為進一步研究奠定了基礎. 1材料和方法 1.1材料pGEM-3zf（-），pThioHisA質(zhì)粒、DH5α，TOP10菌種由本中心保存，T4多核苷酸激酶、T4DNA連接酶、EcoRI、PstI為TaKaRa產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶、DNA分子質(zhì)量標準購自華美生物工程公司，低相對分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)（Mr14400～97400）購自上海麗珠東風生物技術有限公司，I抗Anti-ThioTMAntibody為Invitrogen產(chǎn)品，II抗為Rabbitanti-MouseIgG-AP為華美公
6、司產(chǎn)品.Tα1基因片段及PCR引物由上海博亞生物技術有限公司合成:sequence1（54bp）GACACCAGCAGCGAGATCACCACCAAGGACCGGAAGGAGAAGAAGGAGGTGGTG;sequence2（30bp）GAGGAGGCCGAGAACAGCGACGCCGCCGTG;sequence3（42bp）CTTGGTGGTGATCTCGCTGCTGGTGTCCACGGCGGCGTCGCT;sequence4（42bp）GTTCTCGGCCTCCTCCACCACCTCCTTCTTCTCCTTCAGGTC;上游引物（38bp）GGAATTCATGTCTGATGCAGC
7、CGTGGACACCAGCAGCG;下游引物（35bp）GCACTGCAGTCAGTTCTCGGCCTCCTCCACCACCT. 1.2方法 1.2.1串聯(lián)體基因的獲得將Tα1的氨基酸序列［4］按慣用碼轉(zhuǎn)化為核苷酸序列，并將其拆分成4個片段合成，合成產(chǎn)物的5’端磷酸化后進行退火，退火產(chǎn)物進行PCR擴增.首先95℃處理5min，加入Taq酶后進行30次循環(huán)反應，循環(huán)參數(shù)為:95℃1min，60℃45s，72℃1min，最后一次延伸反應10mi
