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《重組胸腺素α1 的分離純化和活性測(cè)定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、重組胸腺素α1的分離純化和活性測(cè)定 摘要:目的利用融合表達(dá)載體pThioHisA的重組質(zhì)粒pThioHisA-Tα1④，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10得到的工程菌，來分離純化表達(dá)的胸腺素α1（thymosinalpha1，Tα1）.方法將高效表達(dá)融合蛋白的工程菌用細(xì)胞破碎器裂解，經(jīng)80℃熱處理，離心上清采用Q-SepharoseFF陰離子交換色譜純化融合蛋白.融合蛋白經(jīng)Br裂解后用常壓離子交換色譜純化Tα1單體.應(yīng)用SDS-PAGE，2L-Tricine-SDS-PAGE和HPLC進(jìn)行鑒定.結(jié)果SDS-PAGE分析表明菌體表達(dá)的融合蛋白占菌體總
2、蛋白的400gkg-1.經(jīng)2L-Tricine-SDS-PAGE分析證實(shí)，融合蛋白可裂解出Tα1單體，裂解物經(jīng)簡(jiǎn)單的離子色譜可以純化出Tα1單體，HPLC鑒定純化出的Tα1純度可達(dá)950gkg-1以上.利用3H-TdR進(jìn)行的生物活性測(cè)定表明，在致有絲分裂原ConA存在的條件下，融合蛋白和Tα1單體均具有刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞分裂增殖的能力，與化學(xué)合成的Tα1相比具有相似的生物活性.結(jié)論該方法是分離純化Tα1簡(jiǎn)便易行，經(jīng)濟(jì)有效的方法;同時(shí)也為Tα1的分離純化和大規(guī)模的開發(fā)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ). Keyosinalpha1;fusionexpress
3、ion;proteinpu-rification;biologicalactivity Abstract:AIMTopurifyandpreparethymosinalpha1（Tα1）.METHODSTheengineeringbacteriaTOP10includ-ingrebinantplasmidofafusionexpressionvectorpThio-HisATα1geneof4repeats（Tα1④）peratureof80℃for10min-utes，andcooledquickly.ByQ-SepharoseFas
4、tFloatography，thefusionproteinthesuper-natantofthelysate.Attheconcentrionof0.5molL-1Brcleavageofthefusionproteinin700mLL-1formicacid，Tα1ethodsofSP-SepharoseFastFloethodsandprovedby2L-Tricine-SDS-PAGEanalysis.HPLCshoilarbiologicalactivitytothatofthesynthesizedTα1.Theycould
5、increasetheproliferativere-sponseofthemitogenConAstimulatedspleenlymphocytes.CONCLUSIONMethodisconvenientandsimpleforpurifi-cationandpreparationofTα1inlargescale. 0引言 胸腺素α1（thymosinalpha1，Tα1）是從胸腺素組分5（TF5）中分離純化出的由28個(gè)氨基酸殘基組成的酸性多肽，其Mr為3108，pI4.2［1，2］.在各種抗原或致有絲分裂原激活后，Tα1能夠
6、增加T細(xì)胞IFN［3］，IL-2［4］和IL-3［5］等淋巴因子的分泌，增加T細(xì)胞表面淋巴因子受體的水平;Tα1還能影響NK前體細(xì)胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后變得更有細(xì)胞毒性［6，7］;在活體內(nèi)Tα1能增加ConA激活后的小鼠淋巴細(xì)胞增加分泌IL-2并增加IL-2受體的表達(dá)作用［4，7］;配伍其他細(xì)胞因子具有抗腫瘤作用［8］.Tα1臨床用途廣泛，已應(yīng)用于治療乙肝［9］、丙肝［10］、癌癥［8，11］及免疫缺陷［12］等疾病的研究中，是一種針對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫增強(qiáng)劑. 目前國外化學(xué)合成的Tα1已臨床應(yīng)用，但價(jià)格昂貴.我們利用硫氧還蛋白
7、-Tα1④融合基因在E.coli中的表達(dá)，經(jīng)簡(jiǎn)單的預(yù)處理和離子交換色譜，得到了純度較高的融合蛋白，把融合蛋白進(jìn)行裂解獲得了高純度的Tα1單體，且具有較高的生物活性.該研究旨在尋找簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)有效地純化和生產(chǎn)Tα1的技術(shù)方案，為今后的大批量生產(chǎn)奠定切實(shí)可行的工藝流程基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料 1.1.1菌體的獲得重組質(zhì)粒pThioHisA-Tα1④由本中心構(gòu)建，由重組質(zhì)粒pThioHisA-Tα1④轉(zhuǎn)化E.coliTOP10［基因型為FˉmcrAΔ（mrr-hsdRMS-mcrBC）Φ80lacZΔM15ΔlacX74deoR
8、recAlaraD139Δ（ara-leu）7697galUgalKrpsLendAlnupG］.挑單克隆接種于5mLLB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)至A600nm為0.6，按50mLL-1接種于新
