stnfrⅱ和vip融合蛋白的基因克隆表達(dá)、純化及活性檢測(cè)

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1、sTNFRⅡ和VIP融合蛋白的基因克隆表達(dá)、純化及活性檢測(cè)中國(guó)生物工程雜志ChinaBiotechnology,2006,26(5):69—73sTNFRlI和VIP融合蛋白的基因克隆表達(dá),純化及活性檢測(cè)王虹曾位森陳金華王珊珊劉丹楊艷妮陳百宏李玲(廣州藍(lán)星生物科技開發(fā)有限公司廣州510663)摘要可溶性腫瘤壞死因子受體11(sTNFRII)和血管活性腸肽(VIP)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)均有治療作用,但兩者的作用機(jī)制不同.制備兩者融合蛋白,可能具有更好的防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用.用含有VIP基因序列的上游引物和sTNFRII的下游引物,用P

2、CR擴(kuò)增出由連接序列將VIP和sTNFRII基因連接的片段,再亞克隆到原核表達(dá)載體pET32a,在大腸桿菌DH5c~內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá).表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)離子交換,疏水層析純化,并用體外中和試驗(yàn)檢測(cè)其抑制TNF細(xì)胞毒及肝細(xì)胞膜特異性脂蛋白(Lsp)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒生物活性.結(jié)果顯示構(gòu)建的pET32a—VIP—sTNFRII表達(dá)載體在大腸桿菌DH5ct內(nèi)以包涵體形式表達(dá),疏水層析結(jié)合離子交換層析純化后,融合蛋白具有較好的抑制炎癥分子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)生物活性,為將來應(yīng)用打下基礎(chǔ).關(guān)鍵詞sTNFRIIVIP融合蛋白表達(dá)純化中圖分類號(hào)Q786腫瘤壞死因子受體ii(T

3、NFRII)全長(zhǎng)有439個(gè)氨基酸,其中胞外區(qū)有234個(gè)氨基酸.胞外區(qū)富含Cys重復(fù)序列,Cys呈棒狀結(jié)構(gòu),主要負(fù)責(zé)與配基結(jié)合J.胞外區(qū)在特定的情況下可以脫離下來,形成可溶性受體(SolubeTNFreceptor,sTNFR).sTNFR不介導(dǎo)信號(hào)傳遞,但仍能與TNF結(jié)合,中和TNF的活性.當(dāng)sTNFR過量,會(huì)與TNFR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TNF,眾多實(shí)驗(yàn)證明sTNFR在體內(nèi),體外能中和TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)【.美國(guó)Immunes公司已研制出sTNFRII—IgGFc融合蛋白,用于治療類風(fēng)濕病.血管活性腸肽(vasoactiveintesti

4、nalpeptide,VIP)是由28個(gè)氨基酸組成的多肽,能在外周淋巴微環(huán)境中產(chǎn)生具有免疫學(xué)活性的神經(jīng)肽.研究表明VIP有抗炎特性,在調(diào)節(jié)自身免疫方面發(fā)揮重要作用,成為治療RA極有前景的新藥物J.sTNFRII和VIP對(duì)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的作收稿日期:2006-03-06修回日期:2006-04—10通訊作者,電子信箱:laxiwh@263.net用相似,但兩者的作用機(jī)制并不相同.本文構(gòu)建重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌中表達(dá),經(jīng)離子交換柱純化,獲得有生物活性的融合蛋白VIP-sTNFRII,以期在臨床上有更好的治療效果.l材料和方法1.1

5、材料質(zhì)粒,菌株和細(xì)胞株:人心肌細(xì)胞cDNA文庫購(gòu)自LifeTechnology公司.pET32a,大腸埃希菌DH5ot,小鼠成纖維細(xì)胞L929為本實(shí)驗(yàn)室保存.試劑:氧化型谷胱甘肽(GSSG),還原型谷胱甘肽(GSH),精氨酸三羥甲基氨基甲烷(Tris),乙二胺四乙酸(EDTA)均為國(guó)產(chǎn)分析純;LB培養(yǎng)基購(gòu)于Sigma公司;膠回收試劑盒,廣州天為時(shí)代公司;T4連接酶,異丙基硫代.B.D.半乳糖苷(IPTG),各種限制性內(nèi)切酶和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,肝細(xì)胞膜特異性脂蛋白(Lsp)均購(gòu)自Promega公司;TNF—a2b標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京邦定公司;So

6、urce30Q離子交換介質(zhì),Phenyl-SepharoseFF疏水介質(zhì)購(gòu)于Pharmacia公司.引物合成和DNA測(cè)序委托上70中國(guó)生物工程雜志ChinaBiotechnologyVo1.26No.52006海invitrogen公司完成.1.2方法1.2.1VIP-sTNFRII融合蛋白基因克隆根據(jù)DataBank中的基因序列設(shè)計(jì)引物,上下游引物5端分別引入酶切位點(diǎn)BamHI和HindIII.上游引物為:5-TCTAGGAATAACTALTCCACTCTGATGCCGTCTFCACAGCACCCGCCTCAGAAAGCAAATGGCT

7、GTGAAGAAATACCTGAACTCCATCCTGAATGcAG6GGGCHGcAG6GGCG4CCGTCGGACTGGAGCTCT-3.下游引物:5'-CCCAAGCTTCAATCAGTCCAACTGGAAG.3.在上游引物中嵌入VIP的開放閱讀框序列84bp(下劃線部分),兩個(gè)基因間用一個(gè)柔性短肽序列相連(斜體為連接肽序列).用PCR方法以人心肌細(xì)胞cDNA文庫為模板擴(kuò)增sTNFRII基因,并通過上游引物中引入VIP序列,獲得VIP.sTNFRII融合基因.離心沉淀PCR產(chǎn)物,用BamHI和HindlI!雙酶切,l%瓊脂糖凝膠電泳

8、,切下目的條帶(約800bp),DNA凝膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物.純化的產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶切的pET32a載體_5J混合,T4連接酶連接,構(gòu)建pET32a-VIP-TNFRII表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至感受