血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)原理

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1、一、血球計(jì)數(shù)板的使用原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計(jì)菌器），于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，然后推算出含菌數(shù)的一種方法。血球計(jì)數(shù)板是常用的計(jì)菌器之一。血球計(jì)數(shù)板是一種專門用于計(jì)算較大單細(xì)胞微生物的一種儀器，由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個(gè)平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個(gè)方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個(gè)大方格，其中只有中間的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室。這一大方格的長和寬各為1mm，深度為0.1mm，其

2、容積為0.1mm3，即1mm×1mm×0.1mm方格的計(jì)數(shù)板；大方格的長和寬各2mm，深度為0.1mm，其容積為0.4mm3，即2mm×2mm×0.1mm方格的計(jì)數(shù)板。在血球計(jì)數(shù)板上，刻有一些符號和數(shù)字(見圖一)，其含義是：XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板分25個(gè)中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；1/400mm2表示計(jì)數(shù)室面積是1mm2，分400個(gè)小格，每小格面積是1/400mm2。???計(jì)數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是16×25型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格

3、；另一種是25×16型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即每一大方格都是由16×25=25×16=400個(gè)小方格組成。1．16×25型的計(jì)數(shù)板?將計(jì)數(shù)室放大，可見它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個(gè)中方格（100個(gè)小方格）計(jì)數(shù)（見圖二）。將每一中格放大，可見25個(gè)小格。計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)數(shù)完畢后，依下列公式計(jì)算：酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)／1mL=100個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/100×400×10000×稀釋倍數(shù)2．25×16型的計(jì)

4、數(shù)板?中央大方格以雙線等分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，供細(xì)胞計(jì)數(shù)用（見圖三）。一般計(jì)數(shù)四個(gè)角和中央的五個(gè)中方格（80個(gè)小方格）的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)數(shù)完畢后，依下列公式計(jì)算：酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)／1mL＝80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)???????c????????????????????????????????d血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造（三）（25×16）a．頂面觀?b．側(cè)面觀?c．放大后的網(wǎng)格?d．放大后的計(jì)數(shù)室?二、血球計(jì)數(shù)板的使用方法步驟使用血球計(jì)數(shù)

5、板計(jì)數(shù)時(shí)，按照如下的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行：1．鏡檢計(jì)數(shù)室。在加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)；2．加樣品。將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室上加蓋專用的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的酵母菌懸液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，一次性充滿計(jì)數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細(xì)胞懸液的量以不超過計(jì)數(shù)室臺面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。多余培養(yǎng)液可用濾紙吸去；3．計(jì)數(shù)。稍待片刻（約5min），待酵母菌細(xì)胞全部沉降到計(jì)數(shù)室底部后，將計(jì)數(shù)板放在載物臺的中央，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室所在位置后，

6、再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察、計(jì)數(shù)并記錄。三、血球計(jì)數(shù)板的使用注意事項(xiàng)《培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化》實(shí)驗(yàn)是一個(gè)歷時(shí)較長（7天左右）的實(shí)驗(yàn)，事前一定要做好周密的計(jì)劃，定程序、定時(shí)間、定人員。每天采用抽樣檢測法使用血球計(jì)數(shù)板對酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，在計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)從以下幾方面注意。1．每天同一時(shí)間，各組取出本組的試管，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌個(gè)數(shù)，并作記錄，連續(xù)觀察7天。2．從試管中吸出培養(yǎng)液進(jìn)行計(jì)數(shù)之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計(jì)數(shù)的代表性和準(zhǔn)確性，求得的培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量誤差小

7、。3．如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過多，難以數(shù)清，應(yīng)當(dāng)對培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋以便于酵母菌的計(jì)數(shù)。具體方法是：搖勻試管，取1mL酵母菌培養(yǎng)液，加入成倍的無菌水稀釋，稀釋n倍后，再用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，所得數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)。以每小方格內(nèi)含有4—5個(gè)酵母細(xì)胞為宜。特別是在培養(yǎng)后期的樣液需要稀釋后計(jì)數(shù)。4．活酵母有芽殖現(xiàn)象，若芽體達(dá)到母細(xì)胞大小的一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)，若芽體小于母細(xì)胞一半時(shí)為1個(gè)酵母細(xì)胞。5．對于壓在方格界線上的酵母菌應(yīng)當(dāng)計(jì)數(shù)同側(cè)相鄰兩邊上的菌體數(shù)，一般可采取“數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線”的原則處

8、理，另兩邊不計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，如果使用16格×25格規(guī)格的計(jì)數(shù)室，要按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)中格(即100個(gè)小格)的酵母菌數(shù)；如果規(guī)格為25格×16格的計(jì)數(shù)板，除了取其4個(gè)對角方位外，還需再數(shù)中央的一個(gè)中格(即80個(gè)小方格)的酵母菌數(shù)。6．計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算，對每個(gè)樣品可計(jì)數(shù)三次，再取其平均值。計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)不時(shí)調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體。按公式計(jì)算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌個(gè)數(shù)。7．血球計(jì)數(shù)板的