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1、實時定量PCR應(yīng)用中的問題及優(yōu)化方案（轉(zhuǎn)）???2005-11-10聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個能對核酸分子進行精確定量的有力工具[1]。隨著分子生物學技術(shù)研究的不斷進展，定量PCR技術(shù)取得了突飛猛進的發(fā)展，不僅建立了一系列的方法，而且也誕生了許多與這些方法相匹配的新型熱循環(huán)儀和實驗材料。實時定量PCR(real-timequantitativePCR)技術(shù)便是一種具有革命性意義的定量PCR技術(shù)，所謂實
2、時定量PCR是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量[2]。目前它作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學研究的各個領(lǐng)域，僅2000-2001年，收錄在Medline上的以real-timePCR為關(guān)鍵詞的文章就達一千多篇。實時PCR技術(shù)較之與以前的以終點法進行定量的PCR技術(shù)具有無與倫比的優(yōu)勢。首先，它不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴增并進行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進行操作
3、。另外，它還可以通過不同的引物設(shè)計在同一反應(yīng)體系中同時對多個靶基因分子進行擴增，即多重擴增[3,4,5]。本文將對實時定量PCR目前的應(yīng)用狀況、儀器應(yīng)用、新材料進展以及實驗條件的優(yōu)化作一綜述。實時定量PCR的應(yīng)用現(xiàn)狀實時定量PCR技術(shù)自1996年誕生以來，由于它顯著的優(yōu)越性，不僅廣泛的應(yīng)用于分子生物學的各個研究領(lǐng)域，而且也開始作為一種診斷手段應(yīng)用于臨床。其應(yīng)用涉及到的范圍包括DNA、mRNA和病毒荷載量的定量，核酸多態(tài)性分析，基因突變分析等多個領(lǐng)域[3]。Giulietti等人[6]對用實時定量PCR測定細胞因子基因的表達作了詳
4、細的描述。細胞因子是一種調(diào)節(jié)蛋白，它對免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，其量的改變常常與一些疾病，如炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的關(guān)系。由于所得到組織樣本常常因為太小而不能滿足在蛋白質(zhì)水平的檢測，另外，通常用的蛋白質(zhì)檢測方法（如ELISA）的靈敏度也難以完成對極微量的蛋白產(chǎn)物的檢測，所以應(yīng)用PCR定量進行基因診斷就顯得十分有意義。眾所周知，cDNA微排列和差異表達PCR技術(shù)是對基因表達變化分析的兩種關(guān)鍵技術(shù)，但是這兩種技術(shù)只能對基因表達變化進行定性分析，而不能進行定量分析。Rajeevan等人[7]利用實時定量P
5、CR技術(shù)卻成功地將基因表達的變化進行了量化，不僅有效地證明了上述兩種方法的有效性，而且提供了一種具有高通量的對基因表達變化進行檢測的新技術(shù)。實時定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)不僅增強了有關(guān)對基因量變化的研究方法，而且也增強了對基因質(zhì)所發(fā)生變化方面的研究。例如Laird和他的同事們[8]建立了一種被稱作Methylight的實時定量PCR方法，它能通過特異的引物和/或Taqman探針檢測基因CpG島的胞嘧啶是否發(fā)生了甲基化。由于實時PCR的敏感性和特異性，使得這種方法對胞嘧啶的過度甲基化常常具有極高的靈敏度。最近有研究表明這種方法可以從食管
6、癌病人的食管粘膜中檢出含有發(fā)生了過度甲基化基因的細胞[9]。又如Sevall等人[10]證明可以用實時定量PCR方法區(qū)分含有突變的等位基因。這是利用兩種不同的熒光報告基團標記Taqman探針，該探針既可同野生型基因又可同突變型基因發(fā)生雜交，由于探針的雜交效率及隨后的切割是由雜交決定的，所以如果出現(xiàn)一種信號強于另一種信號則表明兩條基因具有同源性，若兩種信號都增強則表明為異源性。目前實時定量PCR在臨床診斷方面的應(yīng)用主要體現(xiàn)在對感染組織或細胞負載病毒的定量測定上，這一技術(shù)對DNA和RNA病毒都可以檢測，目前已有標準的操作手冊供人們使
7、用，但是必須明確，國際上既沒有統(tǒng)一的病毒荷載的標準，也存在著對其標準曲線和定量準確性的各種爭論。這里值得一提的是一種稱為NASBA（nucleicacidsequence-basedamplification）的技術(shù)[11]，它是一種利用電化學以光的等溫PCR反應(yīng)，在反應(yīng)過程中能產(chǎn)生一種與靶RNA反極性的RNA擴增子，分子beacon常用于這種技術(shù)，這種方法常常用于對逆轉(zhuǎn)錄病毒的定量測定。常用的熱循環(huán)儀對PCR產(chǎn)物進行實時定量的測定之所以能成為現(xiàn)實，并且應(yīng)用如此廣泛，其中一個重要的原因就是新的熱循環(huán)儀的研制與推廣。目前，國內(nèi)外常
8、用的熱循環(huán)儀主要有以下幾種：1.PE公司生產(chǎn)的AppliedBiosystem系列：(1)ABIPrism7700SequenceDetectionSystem(SDS)是第一種作為商業(yè)用途的實時PCR測定儀，它由激光激發(fā)熒光，并且可在500-660nm范圍內(nèi)調(diào)
