實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)的原理及應(yīng)用

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1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用在PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量的分析。但是無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng)PCR擴(kuò)增之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一

2、種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不

3、再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。在擴(kuò)增曲線中：熒光閾值(threshold)是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光本底信號(hào)(baseline)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍；Ct值的含義是指在PCR循環(huán)過程中,熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的

4、循環(huán)次數(shù),也就是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)；Rn+表示每點(diǎn)測量的熒光強(qiáng)度,代表反應(yīng)管含有模板DNA;Rn-表示熒光基線強(qiáng)度,代表反應(yīng)管不含有模板DNA,其在理想情況下是一條平線,只具有背景熒光數(shù)值;ΔRn表示PCR過程中,探針降解的量,也即PCR產(chǎn)物的量；基線(8baseline)是背景曲線的一段,范圍為從反應(yīng)開始不久熒光值開始變得穩(wěn)定,到所有反應(yīng)管的熒光都將要但是還未超出背景。（如圖1所示）（圖1）1.1數(shù)學(xué)原理PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每一擴(kuò)增周期后產(chǎn)物的量可以用下式表達(dá)：Yn=Yn-1

5、·(1+Ex)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+Ex)n（0≤Ex≤1）其中Ex表示擴(kuò)增效率，Yn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1表示n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。等式僅在限定的擴(kuò)增周期數(shù)（通常為20或30）內(nèi)成立。超過此周期數(shù)，擴(kuò)增過程即由指數(shù)擴(kuò)增降低至穩(wěn)定的擴(kuò)增速率，最終達(dá)到平臺(tái)，不再擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)擴(kuò)增期來測定起始模板的分子數(shù)量。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中Rn=RB+XO(1+Ex)nRS,也就是說第n次PCR循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(Rn)等于背景信號(hào)強(qiáng)度

6、(RB)加上每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度(即單位熒光強(qiáng)度，RS)與分子數(shù)量XO的乘積。當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=Ct時(shí)，則有RT=RB+XO(1+Ex)CtRS。兩邊取對(duì)數(shù)，得log(RT-RB)=logX0+Ctlog(1+Ex)+logRs。整頓此式，得Ctlog(1+Ex)=-logX0+log(RT-RB)–logRs則而對(duì)于每一個(gè)特定的PCR反應(yīng)來說，Ex、RT、RB和RS8都是常數(shù)，因此上式可以表示為：Ct=-klogX0+b即Ct值與logX0成反比，也就是說，Ct值與起始模板拷貝數(shù)(X0)的對(duì)數(shù)成反比。因此，利用已知起始

7、拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。所以，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)（如圖2所示）。（圖2）1.2化學(xué)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括使用探針和熒光染料兩種，探針是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，后者是利用熒光染料來指示擴(kuò)增的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。1.2.1TaqMan熒光探針PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一段寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記

8、一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步（如圖3所示）。8（圖3）1.2.2SYBRGreenI熒