實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)原理與應(yīng)用

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1、東勝創(chuàng)新技術(shù)通訊EastwinTechnicalNotes─────────實(shí)時(shí)熒光定量PCR專輯2004年4月綜述METHODS25,383–385(2001)doi:10.1006/meth.2001.1260,availableonlineathttp://www.idealibrary.comon實(shí)時(shí)熒光定量PCRThomasD.SchmittgenDepartmentofPharmaceuticalSciences,CollegeofPharmacy,WashingtonStateUniversity,Pullman,WA991

2、64.對(duì)于從90年代初就開始接觸定量PCR的實(shí)驗(yàn)人員來說，他們?cè)缫褜?duì)繁瑣的定量方法習(xí)以為常。早期定量PCR技術(shù)的難點(diǎn)主要在于：（1）如何確定PCR正處于線性擴(kuò)增范圍內(nèi)（只有在此范圍內(nèi)PCR產(chǎn)物信號(hào)才與初始模板的拷貝數(shù)成比例）。（2）一旦線性擴(kuò)增范圍確定以后，如何找到一個(gè)合適的方法檢測(cè)結(jié)果。為了保證線性，研究者要擴(kuò)增一系(1)(2)(3)列梯度稀釋的cDNA或者對(duì)每個(gè)基因的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；有的研究者加一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性模板，有的做限制性(4)(5)的稀釋梯度分析，或者加一個(gè)PCR模擬（mimic）反應(yīng)，即用相似的引物與目標(biāo)產(chǎn)物共擴(kuò)增。而擴(kuò)增

3、產(chǎn)物的檢測(cè)通常在跑膠以后通過染料，放射活性或者探針進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于已經(jīng)開始使用實(shí)時(shí)定量PCR的研究者來說，過去的日子已經(jīng)一去不復(fù)返了。在實(shí)時(shí)PCR中，不再需要擔(dān)心擴(kuò)增的線性和放射性污染，也不再需要跑膠和手工收集數(shù)據(jù)。現(xiàn)在在2到3小時(shí)之內(nèi)拿到數(shù)據(jù)已經(jīng)不再是夢(mèng)想。除此之外，實(shí)時(shí)PCR還有其它的一些優(yōu)點(diǎn)：靈敏度大大提高；可以實(shí)現(xiàn)高通量；所有實(shí)驗(yàn)在封閉系統(tǒng)內(nèi)完成，可變因素大大減少；可以進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，而且不需要后期處理。PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)從誕生到現(xiàn)在已經(jīng)有五年了，但是其應(yīng)用在近兩年才開始迅猛增長(zhǎng)。在Medline數(shù)據(jù)庫(kù)中，用“Taqman”或“

4、real-timeandPCR”作為關(guān)鍵詞搜索，在1996年有19篇文章，在1997年有28篇文章，在1998、1999、2000年文章數(shù)分別達(dá)到了52、157和409篇。在這篇文章寫作的同時(shí)，在2001年已經(jīng)可以找到551篇文章了。許多廠商也正在大力宣傳實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及其相關(guān)的技術(shù)（包括軟件、探針等），而且在不久的將來，會(huì)有更多的產(chǎn)品發(fā)布。針對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR這一熱點(diǎn)領(lǐng)域，我們收集了許多目前用實(shí)時(shí)定量PCR來定量DNA或RNA的方法，匯編成9篇文章，涵蓋了從mRNA和病毒DNA定量到DNA的甲基化和單核甘酸多態(tài)性的擴(kuò)增檢測(cè)。Giul

5、ietti等人描述了通過實(shí)時(shí)PCR對(duì)cytokine基因表達(dá)進(jìn)行定量的方法。因?yàn)檫@一類基因在免疫的諸多方面都起著非常重要的作用，讀者會(huì)發(fā)現(xiàn)這篇文章非常有用，特別是文中列出了許多cytokine基因和看家基因的引物和探針序列。就象大多數(shù)方法一樣，這篇文章描述的定量檢測(cè)cytokine基因表達(dá)的方法可以外推檢測(cè)許多不同種類的mRNA。同時(shí)這篇文章也對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR做了一個(gè)很好的綜述，包括探針的化學(xué)原理和儀器介紹。我們推薦這個(gè)領(lǐng)域的所有新手應(yīng)該先讀讀這篇文章。對(duì)于DNA或RNA的常規(guī)定量來說，有兩種定量方法：絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量檢測(cè)模板

6、數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常要用到標(biāo)準(zhǔn)曲線。在Niesters的文章里討論了絕對(duì)定量用于病毒載量分析的方法。而相對(duì)定量能給出樣本間基因表達(dá)的差異，比如說經(jīng)過處理的樣本和未經(jīng)處理的對(duì)照。通常，給出基因表達(dá)的相對(duì)變化就足夠說明問題了，并不需要給出絕對(duì)量的變化。因?yàn)椴灰鰳?biāo)準(zhǔn)曲線，基因表達(dá)的相對(duì)變化分析比絕對(duì)定量的方法更省時(shí)。對(duì)于那些想得到相-ΔΔCT對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)的研究者來說，Livak和Schmittgen文章中的公式對(duì)于數(shù)據(jù)分析是非常有用的。這篇文章描述了2方-ΔΔCT-ΔΔCT法的推倒、假設(shè)和2在基因相對(duì)表達(dá)分析中的實(shí)際應(yīng)用。文章中也討論了2方法的

7、兩種衍生方法，以及數(shù)據(jù)1東勝創(chuàng)新技術(shù)通訊EastwinTechnicalNotes─────────實(shí)時(shí)熒光定量PCR專輯2004年4月-ΔΔCT分析的一些小竅門。包括表格設(shè)計(jì)等。LehmannandKreipe等人在他們的文章中將2方法用于病人標(biāo)本的定量研究。cDNA芯片和差異顯示是兩種最常用的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)。這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)在于它們只是定性而非定量分析，因而需要用一個(gè)定量的方法確認(rèn)基因表達(dá)的差異，而實(shí)時(shí)PCR就是非常合適的一種手段。Rajeevan等人的文章描述了一種利用SYBR-GreenI通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)產(chǎn)物并進(jìn)行

8、熔解曲線分析的方法，并用該方法對(duì)cDNA芯片和差異顯示PCR技術(shù)的結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)。將實(shí)時(shí)PCR和高通量方法的結(jié)果相互比較就能對(duì)這個(gè)基因是否真的存在表達(dá)差異進(jìn)行確證。相對(duì)于Taqman探針而言，