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1、實時熒光定量PCR技術(shù)原理王秋泉FieldApplicationScientistTel:8008208982/4008208982什么是實時熒光定量PCR??一種實時監(jiān)控核酸擴增的技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化對PCR過程進行實時監(jiān)控，以此實現(xiàn)對初始模板的定量分析。2LifeTechnologies定量PCR如何工作???PCR反應(yīng)液加入了各種類型的熒光標記物一個PCR循環(huán)3LifeTechnologies定量PCR如何工作???在擴增過程中,熒光信號隨著PCR產(chǎn)物的增加而增強PCRPCRPCR產(chǎn)物
2、大量PCR產(chǎn)產(chǎn)產(chǎn)物物物4LifeTechnologies定量PCR如何工作???無論是哪個型號,所有的定量PCR儀器都有三個共同的組成部分2.光源3.檢測器1.熱循環(huán)模塊5LifeTechnologies定量PCR如何工作???每個循環(huán)結(jié)束后,定量PCR儀器通過光學系統(tǒng)記錄熒光信號的增加循循循環(huán)環(huán)環(huán)1濾濾濾光片A樣樣樣品品品1Level:6LifeTechnologies定量PCR如何工作???最后,定量PCR軟件計算出數(shù)據(jù)，用于實驗結(jié)果的分析7LifeTechnologies定量PCR的化學原理8LifeTechnolog
3、ies兩種化學方法TaqMan探針法染料法9LifeTechnologiesTaqMan探針法?TaqMan水解探針：5′端熒光報告基團與靶基因特異性結(jié)合的序列3′端熒光淬滅基團報告基團淬滅基團10LifeTechnologiesTaqMan水解探針作用機理?完整的探針：?切斷的探針：檢測不到報告熒光檢測到報告熒光激發(fā)光激發(fā)光能量熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET11LifeTechnologies變性(95(95oC)oC)12LifeTechnologies退火(60(60oC)oC)13LifeTechnologies14Li
4、feTechnologies15LifeTechnologies16LifeTechnologies17LifeTechnologies18LifeTechnologies?19LifeTechnologiesTaqisspecial...5′-3′外切酶活性水解探針，，使報告基團和淬，使報告基團和淬滅基團分離20LifeTechnologies21LifeTechnologies22LifeTechnologies23LifeTechnologies24LifeTechnologies25LifeTechnologie
5、s26LifeTechnologies27LifeTechnologies28LifeTechnologies29LifeTechnologies30LifeTechnologies31LifeTechnologies32LifeTechnologies33LifeTechnologies34LifeTechnologies35LifeTechnologies36LifeTechnologies37LifeTechnologies38LifeTechnologies39LifeTechnologiesBurp!40LifeT
6、echnologies實時記錄每個循環(huán)后熒光信號的變化熒光循環(huán)數(shù)41LifeTechnologies熒光標記組合報告熒光:6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、TexasRed、CY5淬滅熒光:MGB-NFQ、TAMRA、BHQ參比熒光:ROX常用的熒光組合：FAM目的基因1VIC目的基因2/內(nèi)對照NED目的基因3ROX參比熒光42LifeTechnologies熒光染料組合?7300實時熒光定量PCR系統(tǒng)ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthg
7、h?1FAM?,SYBR~520nm?2VIC,JOE?~550nm455~485nm3NED?，TAMRA?~580nm4ROX?~620nm?7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM?,SYBR?455~485nm~5202VIC?,JOE?510~530nm~5503NED?,Cy3，TAMRA?540~550nm~5804ROX?,TexasRed?570~590nm~6105CY5Dye?630~650
8、nm~65043LifeTechnologies熒光染料組合?StepOne?實時熒光定量PCR系統(tǒng)ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM?,SYBR?455~485nm~5202VIC?,JOE?510
