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1、簡述實時熒光定量PCR技術(shù)1.實時熒光定量PCR技術(shù)的原理所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術(shù)結(jié)合了實時定量PCR儀、實時熒光定量試劑、通用電腦和自動分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。實時PCR的設(shè)想是由Higuchi于1992年最早提出[1]。熒光探針技術(shù)是根據(jù)標記基團的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET)原理而實現(xiàn)的。當(dāng)某個熒光基團的發(fā)
2、射光譜與另一個熒光基團的吸收光譜重疊，且2個基團距離足夠近時，能量可以從短波長(高能量)的熒光基團傳遞到長波長(低能量)的熒光基團，相當(dāng)于短波長熒光基團釋放的熒光被屏蔽，這個過程稱為FRET。定量原理：實時熒光定量PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光基團，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測到的熒光強度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的擴增曲線。理想的擴增曲線應(yīng)為J型，符合2N方程(其中N為PCR的循環(huán)次數(shù))，但實際上擴增曲線為S型。在PCR反應(yīng)早期，不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，因此可以在指數(shù)期的某一點上檢測PCR產(chǎn)物
3、的量，并由此推斷起始模板含量[2-3]。實時熒光定量PCR的標準擴增曲線如圖1。其中Rn+表示每點測量的熒光強度，代表反應(yīng)管含有模板DNA；Rn-表示熒光基線強度，代表反應(yīng)管不含有模板DNA，其在理想情況下是一條平線，只具有背景熒光數(shù)值；△Rn的值表示PCR過程中，探針降解的量，也即PCR產(chǎn)物的量。基線(baseline)是背景曲線的一段，范圍為從反應(yīng)開始不久熒光值開始變得穩(wěn)定，到所有反應(yīng)管的熒光都將要但是還未超出背景。圖1實時熒光定量PCR的標準擴增曲線熒光閾值(threshold)是以PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號(b
4、aseline)，熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號標準差的10倍，即：Threshold=10SD(cycle3-15)，一般認為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個可信的信號，可以用于定義一個樣本的Ct值。Ct值也稱閾值循環(huán)(thresholdcycle)，指在PCR循環(huán)過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，也就是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究結(jié)果表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品可作出標
5、準曲線，因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。簡單地說，實時熒光定量PCR的基本原理就是樣本核酸擴增呈指數(shù)增長，在反應(yīng)體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴增產(chǎn)物的對數(shù)成正比，由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標記物(熒光探針)與擴增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴增產(chǎn)物量成正比，因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。2.實時熒光定量PCR技術(shù)的類型及特點實時熒光定量PCR技術(shù)的常用機制包括熒光染料檢測和水解探針檢測。2.1SYBRGreenI檢測SYBRGreenI是一種能結(jié)合到dsDNA小溝部位的具
6、有綠色激發(fā)波長的染料，它只有與dsDNA結(jié)合后才會發(fā)出熒光。在變性時，DNA雙鏈分開，不產(chǎn)生熒光；在復(fù)性和延伸時，形成dsDNA，SYBRGreenI發(fā)出熒光。熒光強度逐漸增強，直到達到閾值，被熒光探測系統(tǒng)檢測到[4]。因此，熒光強度可以代表擴增產(chǎn)物的數(shù)量。SYBRGreenI的優(yōu)點在于：①成本較低，不需合成和標記探針；②適合初步篩查：選用SYBR篩查，再用探針法精確定量少數(shù)關(guān)鍵樣品。但其缺點有：①特異性差，不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號，所以在低樣本濃度時，不能進行基因突變分析。但該方法可利用熔點曲線分析將特異產(chǎn)物、引物二聚體和非特異
7、性產(chǎn)物區(qū)別開來，不需要通過電泳鑒定；②不能做多重檢測，每孔只能檢測1個目標基因；③靈敏度低，適合于5000拷貝以上的基因定量。2.2TaqMan探針PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。圖2
8、常規(guī)TaqMan探針檢測原理常規(guī)TaqMan探針的5’端標記熒光發(fā)射基團FAM(6-羧基熒光素)，3’端標記熒光淬滅基團TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。該探針在PCR過程中不
